張振博 李怡君 陳靖毅 王 順 崔安鳳 向 萌 楊葉虹 張麗紅

(1復旦大學基礎醫(yī)學院解剖與組織胚胎學系,2生理與病理生理學系 上海 200032;3復旦大學附屬華山醫(yī)院內分泌科 上海 200040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD) 是一種以進行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。在伴有AD的高血壓患者臨床治療中,血管緊張素轉換酶抑制劑培哚普利(perindopril)在降低患者血壓的同時能夠顯著改善認知功能[1],但其機制尚不明確。針對AD發(fā)病機制有多種學說(如基因突變學說、Aβ毒性學說、tau蛋白異常修飾學說、微量元素學說等),這些學說從不同的角度解析了AD的發(fā)病及病理過程。近年來的大量研究證實,鋅、鐵、銅等金屬離子與AD的發(fā)病及病理過程密切相關,而應用金屬螯合劑可顯著改善AD模型小鼠的認知功能[2-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的游離鋅離子主要存在于鋅能神經(jīng)元(zinc-enriched neurons,ZEN)的突觸小泡內,在突觸活動過程中,鋅離子和谷氨酸共同釋放到突觸間隙并轉運進入突觸后神經(jīng)元,進而激活對突觸可塑性的形成有重要作用的蛋白[4]。鋅缺乏和鋅過量都可導致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[4-5],腦鋅穩(wěn)態(tài)的維持對于保持認知功能的穩(wěn)定性具有重要的生理和病理意義。培哚普利能有效調節(jié)消化道對鋅離子的吸收水平[6],提示培哚普利在機體鋅離子穩(wěn)態(tài)調控中可能發(fā)揮重要作用。但培哚普利作為一種能夠有效穿過血腦屏障的經(jīng)典抗高血壓藥物[7],是否通過調控腦內金屬離子穩(wěn)態(tài),尤其是鋅穩(wěn)態(tài),改善AD認知功能,尚未見報道。

為明確培哚普利對腦內金屬離子的調控作用及其機制,本研究以APP/PS1 轉基因小鼠為研究對象,檢測培哚普利對小鼠認知功能,鋅離子、鐵離子、錳離子、銅離子、鎂離子、鈣離子含量及鋅轉運體(Zn transporters,ZnTs)家族成員(ZnT1、ZnT2、 ZnT3、ZnT4 、ZnT5、 ZnT6、 ZnT7)mRNA表達水平的影響,以期為進一步明確培哚普利改善AD認知功能的機制研究提供可靠的實驗依據(jù),并為AD的藥物治療提供新的靶點和思路。

材 料 和 方 法

水迷宮實驗應用morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(SANS,江蘇賽昂斯生物科技有限公司)連續(xù)測試小鼠6天、每天1次。實驗房間保持黑暗,安靜。每次由4個試驗組成,60 s作為一次試驗的時間。每個試驗過程如下:將小鼠從水池邊緣的4個不同象限(東、南、西、北)面向水池壁放入,讓其在具有隱藏平臺的水池中自由游泳60 s,直到找到平臺,并在平臺上停留3 s,記作其逃避潛伏期;如果找不到平臺,引導其在平臺上停留10 s,將逃避潛伏期記作60 s。第6天將平臺撤掉,將小鼠依次從東、南、西、北4個象限放入水池,自由泳60 s,視頻設備記錄其穿越平臺次數(shù)。

電感耦合等離子體質譜檢測小鼠連續(xù)灌胃3個月后,腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉后,斷頭處死,迅速取大腦皮層組織。取組織前準備足量0.5 mL的離心管并使用分析天平稱量其重量,精確至小數(shù)點后4位,記錄相應數(shù)據(jù)后取每只小鼠大腦皮層組織50～100 mg置于相應離心管內,稱取總重量,同樣精確至小數(shù)點后4位;用200 μL槍頭將離心管內的組織轉移至消解罐,同時分別加200 μL濃硝酸至離心管內,沖洗內壁后分別轉移至相應消解罐中,記錄消解罐對應樣本的順序,將消解罐按照順序放入消解儀中,啟動消解程序,消解完成后使用超純水將內塞上的消解液轉移至相應的消解罐內,將消解罐按順序放入趕酸儀中,120 ℃ 3～4 h,將液體層轉移至相應的離心管中,定容至相同體積后上機做電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)檢測(iCAP tm RQ ICP-MS,美國Thermo Fisher公司)。

real-time PCRTrizol法提取小鼠大腦皮層組織總RNA,逆轉錄合成cDNA,real-time PCR檢測小鼠大腦皮層組織中ZnT1、ZnT2、 ZnT3、ZnT4 、ZnT5、 ZnT6和 ZnT7的mRNA表達水平。反應條件為95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)40次,引物序列見表1。

統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism7軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,兩組之間使用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

培哚普利改善AD模型小鼠認知功能兩組小鼠連續(xù)灌胃3個月后,進行水迷宮實驗,統(tǒng)計軟件分析各組小鼠的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)及游泳總距離。結果顯示,與對照組AD小鼠相比,培哚普利組小鼠在第1、2、5、6天的逃避潛伏期分別降低35.8%、34.1%、46.7%和61.2%,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.002 3,0.012 7,0.002 6和0.000 7)(圖1A);培哚普利組小鼠第6天的逃避潛伏期相比第1天降低54.4%(P<0.000 1),而對照組小鼠第6天的逃避潛伏期相比第1天僅降低24.5%(P<0.000 1);與對照組AD小鼠相比,培哚普利組小鼠穿越平臺的次數(shù)由0升至1,且差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.000 1,圖1B);對照組和培哚普利組小鼠游泳總距離分別是532和829 cm,各組間差異無統(tǒng)計學意義(圖1C)。

表1 基因及其對應的引物序列Tab 1 Gene and the primer sequence

A:Escape latency;B:Number of platform crossings on the sixth day;C:Total swimming distance.In each group,n=5.(1)P<0.001,(2)P<0.005,(3)P<0.001.ND:Not detected.

圖1 水迷宮檢測培哚普利對APP/PS1小鼠認知功能的影響
Fig 1 Effect of perindopril on cognitive function of APP/PS1 mice by morris water maze test

培哚普利對小鼠大腦皮層中金屬微量元素含量的影響兩組小鼠進續(xù)灌胃3個月后取大腦皮層,應用ICP-MS技術檢測鋅、鐵、錳、鎂、鈣、銅元素含量的變化。結果顯示,與對照組小鼠相比,培哚普利組小鼠大腦皮層中鋅離子含量升高27% (P=0.004 2),而培哚普利與對照組小鼠大腦皮層的鐵、錳、鎂、鈣、銅元素含量未見顯著性差異(圖2)。

The contents of zinc ion in perindopril group was increased by 27%(P=0.0042).There was no significant difference in the contents of iron ion,manganese ion,magnesium ion,calcium ion or copper ion between the two groups (n=5).

圖2 ICP-MS檢測培哚普利對APP/PS1小鼠大腦皮層
中金屬微量元素含量的影響
Fig 2 Effects of perindopril on the contents of metal elementsin cerebral cortex of APP/PS1 transgenicmouse detected by ICP-MS

培哚普利對小鼠大腦皮層中鋅轉運體mRNA表達的影響real-time PCR結果顯示,與對照組小鼠相比,培哚普利組小鼠大腦皮層中鋅轉運體ZnT1的表達降低38%(P=0.002 2)。培哚普利組與對照組小鼠相比,大腦皮層中ZnT2、ZnT3、ZnT4、ZnT5、ZnT6、ZnT7的mRNA表達未見顯著性差異(圖3)。

討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是嚴重影響老年人健康的神經(jīng)退行性疾病,隨著我國人口的日益老齡化,AD的發(fā)病呈逐年上升趨勢[8-9]。由于目前缺乏有效的治療手段,尋找AD治療的新靶點及相關藥物具有重要的臨床和社會意義。

AD的典型病理特征為腦內Aβ老年斑的形成,然而,以Aβ作為AD治療靶點的多項藥物開發(fā)與臨床試驗均未能有效改善AD的認知功能[10-11],Aβ老年斑的形成是導致認知損傷的原因抑或是機體反應性保護的結果,尚有待進一步深入探討[11-12]。因此,AD治療新靶點是目前改善AD認知功能治療的重要方向之一。抗高血壓藥物,特別是鈣通道阻滯劑和腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻滯劑(如培哚普利),有助于預防認知功能減退和癡呆[13],能夠減輕東莨菪堿所致的記憶缺陷,并表現(xiàn)出增強記憶的作用[14]。培哚普利與依達帕胺聯(lián)合治療12個月可改善動脈高壓患者的內皮細胞功能、微循環(huán)結構和功能參數(shù)以及認知功能[15]。培哚普利和替莫酚通過調節(jié)腦源性神經(jīng)調節(jié)因子、神經(jīng)炎癥和氧化亞硝基應激,對脂多糖誘導的認知障礙和淀粉樣變有保護作用[16]。本研究以APP/PS1轉基因小鼠為AD模型小鼠,采用水迷宮實驗證實,培哚普利可以顯著改善APP/PS1轉基因小鼠的認知功能,提示血管緊張素類藥物在AD治療中的潛在作用。

The expression of ZnT1 in perindopril group was reduced by 38%.There was no significant difference in the expression of ZnT2,ZnT3,ZnT4,ZnT5,ZnT6,ZnT7 between the two groups (n=5).

圖3 real-time PCR檢測培哚普利對APP/PS1小鼠
大腦皮層中鋅轉運體mRNA表達的影響
Fig 3 Effect of perindopril on the expression ofzinc transporter mRNA in cortex of APP/PS1mice by real-time PCR

微量元素水平與AD的病理發(fā)生過程密切相關,AD患者腦內鋅、鐵、銅等離子含量升高,同時伴隨著血液和腦脊液中部分離子水平下降[17-19]。我們前期的研究結果證實,鋅在AD患者尸檢腦組織及APP/PS1轉基因小鼠腦組織的Aβ斑塊中高度富集[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn),APP/PS1轉基因小鼠在應用培哚普利3個月后,大腦皮層的鋅離子含量顯著增加,證實了培哚普利對腦鋅代謝的調控作用。基于培哚普利對認知功能的改善作用,我們推測促進鋅離子在大腦皮層內的聚集可能是培哚普利改善AD認知的重要機制之一,調控鋅離子穩(wěn)態(tài)可能成為AD治療的重要途徑。

然而,鋅離子不能自由通過細胞膜和細胞器膜,ZnTs、金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)和ZIP家族是調控機體鋅離子轉運的3個重要蛋白家族[4,23]。ZnT家族成員的主要作用是將鋅運出細胞或隱藏在細胞器內,以降低細胞質內的鋅離子濃度。ZnT1是ZnT家族中最先被發(fā)現(xiàn)的鋅轉運體,也是ZnT家族中唯一定位在細胞膜上的成員,其功能是將鋅離子外排出細胞,從而維持細胞內外鋅水平的穩(wěn)定。ZnT3定位在突觸小泡膜上,其功能是將鋅離子轉運至突觸小泡內,使鋅離子聚集在突觸小泡內并在突觸活動時釋放到突觸間隙。ZnT家族的其他成員主要定位在細胞內的各種細胞器膜上,通過向細胞器內轉運鋅離子而降低細胞質內的鋅離子濃度。已有多項研究證實,AD患者及APP/PS1轉基因小鼠腦內存在ZnTs表達的變化[24-26]。為進一步明確培哚普利調控腦鋅代謝的機制,我們檢測了APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層ZnTs的mRNA表達水平,結果發(fā)現(xiàn),ZnT1作為唯一定位在細胞膜上的ZnTs家族成員,其mRNA表達顯著下降,證明培哚普利可通過調控ZnT1的表達水平,進而影響鋅離子的分布、改善AD的認知水平。

綜上所述,培哚普利可以通過下調大腦皮層ZnT1表達,調控腦鋅代謝,進而改善APP/PS1轉基因小鼠認知功能,提示調控腦內鋅穩(wěn)態(tài)是培哚普利改善AD認知水平的重要機制之一。