基于李府貢棗轉(zhuǎn)錄組測序的SSR和SNP特征分析

周軍永　陸麗娟　劉茂　朱淑芳　仇鵬輝　孫其寶

摘要：為了簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism，SNP）開發(fā)等研究，以李府貢棗不同處理棗果實的轉(zhuǎn)錄組序列為基礎，分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR和SNP位點的分布。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得了226 488條contig序列，其中有42 570條unigene在數(shù)據(jù)庫中得到注釋。利用鑒定簡單重復序列的軟件（MIcroSAtellite identification tool，MISA）進行SSR位點的搜索，共得到18 016個SSR位點，SSR位點的出現(xiàn)頻率為0.43個/kb。SSR位點共包含164種重復基元，其中以A/T類型為主的單核苷酸重復所占的比例最高（6 942個，38.44%），其次是AG/CT類型為主的二核苷酸重復（6 113個，33.85%）和以AAG/CTT為主的三核苷酸重復（4 242個，23.49%），四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復基本相同。在轉(zhuǎn)錄組得到的unigene中共發(fā)現(xiàn)SNP位點163 360個，發(fā)生頻率為1/254 bp，6種單核普酸變異中以Transition類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別為總數(shù)的30.80%和30.49%;其他4種Transversion類型的SNP為C/G、G/T、A/C和A/T，分別占到總數(shù)的9.83%、978%、9.78%和9.32%。其中Transition類型顯著高于Transversion類型，在轉(zhuǎn)換類型中A/G和C/T發(fā)生頻率基本一致，但以A/G發(fā)生頻率略高。

關鍵詞：棗;轉(zhuǎn)錄組;SSR;SNP;特征分析

中圖分類號： S665.101? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0051-04

棗（Ziziphus jujuba Mill.）具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，在我國栽培歷史悠久，是許多省份和地區(qū)重要的經(jīng)濟林樹種，棗產(chǎn)業(yè)成為當?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)之一。我國棗種質(zhì)資源豐富、品種繁多，近年來國內(nèi)外學者利用簡單重復序列間擴增（inter-simple sequence repeat，ISSR）[1-2]、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[3]等分子標記技術(shù)在棗的品種分類、鑒別以及遺傳多樣性方面開展了相關研究工作。

簡單重復序列是由1～6個堿基組成的簡單串聯(lián)重復序列，普遍存在于真核生物基因組[4]，SSR按來源可分為有基因組SSR和轉(zhuǎn)錄組來源的SSR[5]，與基因組SSR相比，轉(zhuǎn)錄組來源的SSR無須構(gòu)建基因組文庫等工作。SSR標記具有影響轉(zhuǎn)錄、基因調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)功能以及基因組構(gòu)[6-7]，被認為是遺傳學研究中最理想的分子標記手段之一[8]，同時轉(zhuǎn)錄組來源的SSR反映了基因組的編碼區(qū)域，直接獲得物種基因表達信息，因此EST-SSR多態(tài)性可能與基因功能直接相關[9]。與常規(guī)的AFLP、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、ISSR等分子標記相比，SSR標記具有數(shù)量豐富、分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等特點，由于棗SSR標記開發(fā)較晚，目前SSR標記已被應用于棗指紋圖譜構(gòu)建、親緣關系、遺傳多樣性分析等研究領域[10-11]。SNP標記是指基因組DNA序列中由于單個核普酸替換或較短片段的插入缺失所引起的多態(tài)性，以其分布廣泛、穩(wěn)定性強等優(yōu)點已被廣泛應用于的遺傳分析領域，SNPs標記在蘋果、西瓜、柑橘、葡萄、柿等作物中得到了開發(fā)和利用[12-13]。目前，在棗中開發(fā)了一些基因組SSR[14]和轉(zhuǎn)錄組SSR標記[15]，分別在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上分析了棗微衛(wèi)星的特點;而棗SNP研究處于標記發(fā)現(xiàn)階段，研究報道較少。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對李府貢棗不同處理果實進行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)組裝，通過分析其特征為SSR和SNP標記的開發(fā)和利用提供生物信息學基礎，同時為棗遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化以及構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎，也將為其功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學的研究等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料取自安徽省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所棗種質(zhì)資源圃，2016年選取樹齡5年，處于盛果期的李府貢棗為試材，當棗果實進入白熟期后進行灌水處理，分別設置ZJ（未灌水）、ZJ1（灌水后8 h）、ZJ2（灌水后30 h）、ZJ3（開裂）等4個處理，處理后分別采集果實表皮各2份，液氮冷凍后在 -80 ℃ 保存。

1.2 總RNA的提取

采用TRIzol試劑提取棗果實總核糖核苷酸（RNA），提取后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后利用安捷倫2100芯片生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）檢測提取的RNA是否達到轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）的試驗標準。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝

提取的棗果皮總RNA經(jīng)脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）處理后，用帶有多聚胸腺嘧啶[Oligo（dT）]的磁珠富集真核生物信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）。然后加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，并以打斷后的mRNA為模板用六堿基隨機引物（random hexamers）合成1鏈互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），加入緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）和DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ）合成cDNA第2鏈，經(jīng)試劑盒純化回收、黏性末端修復、3′末端加上堿基“A”和連接測序接頭，再將得到的片段進行大小選擇后PCR擴增富集。構(gòu)建好的文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和美國應用生物系統(tǒng)公司的實時熒光定量PCR儀（ABI StepOnePlus Real-Time PCR System）質(zhì)檢合格后使用Illumina測序平臺進行測序。轉(zhuǎn)錄組測序工作由深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司完成。對4份棗果皮樣品測序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的測序序列（read）得到干凈序列（clean reads）。利用轉(zhuǎn)錄組Trinity組裝軟件對所有樣品的干凈序列進行混合拼接成轉(zhuǎn)錄本序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本為基因組數(shù)據(jù)庫，得到的基因組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫用于后續(xù)分析。

1.4 SSR和SNP分析方法

SSR位點搜索主要是利用MISA軟件（http：//pgrc. ipk-gatersleben. de/misa/）搜索得到基因組數(shù)據(jù)庫，其參數(shù)設置：單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基的最短重復次數(shù)分別為12、6、5、5、4、4。

SNP位點的搜索通過Samtool和Picard-tools等工具對比對結(jié)果進行染色體坐標排序、去掉重復的序列等處理，最后通過變異檢測軟件UATK3進行單核苷酸多態(tài)性標記調(diào)用（SNP calling），并對原始結(jié)果進行過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

提取的總RNA樣品先進行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，28S和18S條帶明亮，無雜質(zhì)。

Aligent2100檢測總RNA樣品質(zhì)量，RNA完整值（RNA integrity number，RIN）都在7.0～8.0之間，總RNA的濃度和總量等指標均已達到測序要求，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序等試驗（表1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果及統(tǒng)計

棗果實轉(zhuǎn)錄組測序共獲得41 471 760條干凈序列，對干凈序列進行組裝拼接獲得226 488條拼接序列。拼接序列長度范圍主要分布在200～2 000 bp之間，其中以200～300 bp序列數(shù)量居多，約占總拼接序列的61.70%，大于2 000 bp的序列約占總拼接序列的4.64%（表2）。

組裝拼接獲得42 570條基因組數(shù)據(jù)庫，序列長度主要分布在300～3 000 bp范圍內(nèi)，平均長度為974 bp。300～2 000 bp 序列數(shù)量最多，占全部基因組數(shù)據(jù)庫序列的8739%;2 000～3 000 bp 的基因組數(shù)據(jù)庫序列有3 651條，占全部基因組數(shù)據(jù)庫序列的8.58%;≥3 000 bp的基因組數(shù)據(jù)庫序列有1 719條，占 4.04%（表3）。

2.3 微衛(wèi)星特征分析

2.3.1 微衛(wèi)星數(shù)量及分布特點 在轉(zhuǎn)錄組的42 570條基因組數(shù)據(jù)庫序列中發(fā)現(xiàn)18 016個SSR位點，其中包含1 442個混合型SSR和13 033個完整型SSR位點，完整型SSR占總SSR位點的72.3%，包含2個及以上SSR位點的基因組數(shù)據(jù)庫共有3 762條。SSR位點的出現(xiàn)頻率為0.43個/kb，即每2.3 kb就出現(xiàn)1個SSR位點。

SSR位點共包含164種重復基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。其中SSR重復基元的重復次數(shù)均在4～35次，重復4～10次的SSR位點共有10 606個，占總SSR的58.87%，主要為二核苷酸和三核苷酸;重復11～16次的SSR位點有3 780個，占20.98%，主要為單核苷酸和二核苷酸;重復17～20、21～35次的SSR位點基本為單核苷酸（表4）。

在微衛(wèi)星中，單核苷酸重復（6 942個，38.53%）最多，其次是二核苷酸重復（6 113個，33.93%）和三核苷酸重復（4 242個，23.55%），四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復基本相同（219、242、258個）（圖2）。

2.3.2 微衛(wèi)星不同優(yōu)勢重復單元堿基的特征分析 SSR位點共包含164種重復基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。通過對棗不同類型SSR重復單元數(shù)量的變化的統(tǒng)計得出頻率最高的4類基序，依次為A/T（6 871個，38.14%）、AG/CT（3 713個，20.61%）、AT/AT（1 998個，1109%）和AAG/CTT（1 462個，8.12%）。

在2種單核苷酸重復微衛(wèi)星中，以A/T為最主要的重復單元，共有6 871個，占98.98%，而C/G只占1.02%。

二核苷酸重復類型有4種（AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG），其中AG/CT重復的數(shù)量最多，共有3 713個，占二核苷酸重復微衛(wèi)星總數(shù)的60.74%;其次是AT/AT（1 998個），占32.68%;再次是AC/GT（396個），占6.48%;而CG/CG只有6個，占0.10%（圖3）。

三核苷酸重復類型有10種，AAG/CTT重復的數(shù)量最多，共有1 462個，占4.46%;其次是AAT/ATT（645個）、ACC/GGT（521個）、ATC/ATG（477個）;再次是AAC/GTT（360個）、AGG/CCT（298個）、AGC/CTG（283個），其他重復類型則相對較少。

在19種四核苷酸重復類型中，以AAAT/ATTT重復數(shù)量最多，共113個，占四核苷酸SSR總數(shù)的51.60%;其次為AAAG/CTTT，有27個，占12.33%。五核苷酸重復類型有32種，AAAAT/ATTTT重復數(shù)量最多，有104個，占42.98%。六核苷酸重復類型有97種，共258個，但每種重復類型數(shù)量都較少。

通過對棗果實轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星數(shù)量分析可知，單核苷酸重復次數(shù)主要集中在12～20次，且隨著重復次數(shù)增加呈遞減趨勢，未發(fā)現(xiàn)重復24次以上的單核苷酸微衛(wèi)星序列。二核苷酸微衛(wèi)星重復次數(shù)集中在6～11次;三核苷酸微衛(wèi)星重復次數(shù)集中在5～8次;四核苷酸微衛(wèi)星重復次數(shù)集中在5～6次;而五核苷酸微衛(wèi)星和六核苷酸微衛(wèi)星重復次數(shù)最少，為4～5次。

2.3.3 微衛(wèi)星長度分布 微衛(wèi)星長度也存在極顯著變異，長度變化范圍為12～248 bp，平均長度為21 bp。以重復長度為10～20 bp的短序列最多，占80.12%;其次為長度在21～29 bp 的序列，占總數(shù)的12.18%;長度大于50 bp的長序列占微衛(wèi)星總數(shù)的4.36%（圖4）。

2.4 SNP位點的特征分析

在轉(zhuǎn)錄組得到的基因組數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)SNP位點163 360個，發(fā)生頻率為1/254 bp，即每254 bp就會有1個SNP位點出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)換100 122個，顛換63 238個。6種單核苷酸變異中以轉(zhuǎn)換類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別為總數(shù)的30.80%和30.49%;其他4種顛換類型的SNP為C/G、G/T、A/C和A/T，分別占到總數(shù)的9.83%、9.78%、9.78%和932%。其中轉(zhuǎn)換類型顯著高于顛換類型，在轉(zhuǎn)換類型中 A/G 和C/T發(fā)生頻率基本一致，但以A/G發(fā)生頻率略高。

3 結(jié)論與討論

在李府貢棗轉(zhuǎn)錄組的42 570條基因組數(shù)據(jù)庫序列中發(fā)現(xiàn)18 016個SSR，其中包含1 442個混合型SSR和13 033個完整型SSR位點，SSR位點的出現(xiàn)頻率為0.43個/kb，比桃（0.31）、棗（0.36）出現(xiàn)頻率[15-16]低，與柿SSR位點出現(xiàn)頻率[13]相同，表明本研究中李府貢棗SSR標記的數(shù)量極其豐富，有望在SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性等領域得到廣泛應用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組獲得的微衛(wèi)星中單核苷酸重復最多，占38.44%;其次是二核苷酸重復（33.85%）和三核苷酸重復（23.49%），四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復基本相同，與前人關于棗轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星特征基本相同，但本研究獲得258個六核苷酸重復類型?；蚪M序列的微衛(wèi)星特征與轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星序列相比，六堿基重復微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率明顯高于其他類型，棗轉(zhuǎn)錄組比基因組低級基元頻率高，而高級基元比基因組的低，與前人研究[14-15]基本一致。

SSR位點共包含164種重復基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。其中SSR重復基元的重復次數(shù)均在4～35次，重復4～10次的SSR位點共有10 606個，占總SSR的58.87%，主要為二核苷酸和三核苷酸;重復11～16次的SSR位點有3 780個，占20.98%，主要為單核苷酸和二核苷酸;重復17～20次和21～35次的SSR位點基本為單核苷酸。SSR長度變化范圍為10～248 bp，平均長度為 21 bp，以重復長度為10～20 bp的短序列最多，占80.07%。

通過對本研究結(jié)果分析可知，單核苷酸重復微衛(wèi)星為棗最優(yōu)勢微衛(wèi)星，所占比例最多，而且單核苷酸微衛(wèi)星重復單元次數(shù)的變化明顯高于其他重復類型，其次是二核苷酸微衛(wèi)星，說明單核苷酸在整個棗轉(zhuǎn)錄組中變異最為活躍。此外，SSR序列以重復長度為10～20 bp的短序列最多，此類SSR位點擁有高度多態(tài)性。SSR的長度和重復次數(shù)是影響分子標記多態(tài)性的重要因素[17]，說明轉(zhuǎn)錄組獲得的SSR位點可為棗遺傳多樣性和親緣關系等研究有重要的價值。

單核苷酸多態(tài)性在植物基因組中廣泛存在[18-19]。本研究中共發(fā)現(xiàn)SNP位點163 360個，發(fā)生頻率為1/254 bp，與柿發(fā)生頻率[13]基本一致，但與水稻和玉米等作物相比發(fā)生頻率低。所獲得的SNP位點中Transition類型顯著高于Transversion類型。6種單核普酸變異中以Transition類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高。轉(zhuǎn)錄組來源的SSR、SNP多位于基因組的編碼區(qū)域，可直接獲得物種基因表達信息，可能與基因功能直接相關，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為SSR和SNP標記的開發(fā)和利用提供生物信息學基礎，同時為棗遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化以及構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎，也將為其功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學、分子輔助育種等研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]孫 俊，孫雯雯，周軍永，等. 安徽及周邊地區(qū)棗種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[J]. 園藝學報，2015，42（8）：1569-1575.

[2]原勤勤，文亞峰，劉 儒，等. 棗優(yōu)良品種親緣關系的ISSR分析[J]. 經(jīng)濟林研究，2012，30（1）：56-61.

[3]王永康，田建保，王永勤，等. 棗樹品種品系的AFLP分析[J]. 果樹學報，2007，24（2）：146-150.

[4]Mrazek J，Guo X，Shah A. Simple sequence repeats inprokaryotic genomes[J]. PNAS，2007，10（4）：8472-8477.

[5]王 東，曹玲亞，高建平. 黨參轉(zhuǎn)錄組中SSR位點信息分析[J]. 中草藥，2014，46（8）：2390-2394.

[6]Kashi Y，King D G.Simple sequence repeat as advantageous mutators in evolution[J]. Trents in Gentic，2006，22（5）：253-259.

[7]Lawson M J，Zhang L.Patterns of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genomes[J]. Genome Biology，2006，7（2）：R14.

[8]Liu T，Zhu S，F(xiàn)u L，et al. Development and characterization of 1827 expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers for ramie（Boehmeria nivea L. Gaud）[J]. PLoS One，2013，8（4）：e60346.

[9]Eujayl I，Sorrells M，Banm M，et al.Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，104（2）：399-407.

[10]麻麗穎，孔德倉，劉華波，等. 36份棗品種SSR指紋圖譜的構(gòu)[J]. 園藝學報，2012，39（4）：647-654.

[11]劉秀云，李 慧，劉志國，等. 基于SSR標記的255個棗品種親緣關系和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2016，49（14）：2772-2791.

[12]姚丹青，樓堅鋒，顧芹芹. SNP在農(nóng)作物遺傳分析中的應用[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，2015，6：26-27.

[13]杜改改，孫 鵬，索玉靜，等. 基于柿雌雄花芽轉(zhuǎn)錄組測序的SSR和SNP多態(tài)性分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2017，22（10）：45-55.

[14]馬秋月，戴曉港，陳贏男，等. 棗基因組的微衛(wèi)星特征[J]. 林業(yè)科學，2013，49（12）：81-87.

[15]魏琦琦，林 青，賈寶光，等. 棗轉(zhuǎn)錄組序列的微衛(wèi)星特征分析[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2015，35（6）：93-97.

[16]Wang L，Zhao S，Gu C.Deep RNA-Seq uncovers the peach transcriptome landscape[J]. Plant Molecular Biology，2013，83（4/5）：365-377.

[17]趙雅楠，王 穎，張東杰，等. 小豆SSR-PCR反應體系優(yōu)化及引物篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（11）：33-37.

[18]雷 雨，張雪芳，羅鑫磊，等. 不同成熟期桃品種NAC基因遺傳多樣性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（22）：46-49.

[19]李貝貝，劉崇懷，姜建福，等. 葡萄品種分子鑒定研究進展及展望[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（15）：15-20.莊倩倩，陳少鵬，劉洪章. 紫萼玉簪HvGASA、HvFAD基因的克隆及表達分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（4）：55-60.