白芨病菌拮抗菌株的篩選及鑒定

毛儀楠　鄧百萬

摘要：從白芨根際土壤中篩選出對(duì)白芨根腐病有拮抗性的菌株，初步研究其抑菌作用，為白芨病害的生物防治提供參考依據(jù)。采用平板稀釋法從白芨根際土壤中分離獲得菌株，以白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑菌為靶標(biāo)菌采用平板對(duì)峙法篩選出拮抗菌株;分別采用16S rDNA和28S rDNA序列分析方法鑒定拮抗細(xì)菌和真菌菌株的分類學(xué)地位。結(jié)果：共計(jì)從白芨栽培土壤中分離到35株細(xì)菌和10株真菌菌株，其中8株細(xì)菌和6株真菌對(duì)4種白芨致病菌表現(xiàn)較好的抑菌活性;經(jīng)鑒定，細(xì)菌菌株大多數(shù)為芽孢桿菌，真菌為木霉屬，BJ-135為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），BJ-175為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），BJ-2為木霉（Trichoderma asperellum）。篩選出的菌株中有5株拮抗菌對(duì)4種白芨致病菌均有較好的抑菌活性，菌株BJ-135、BJ-175、BJ-2可用于生防菌劑開發(fā)，用于白芨病害防治。

關(guān)鍵詞：白芨;根際微生物;致病菌;拮抗菌;抑菌活性

中圖分類號(hào)： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0103-04

白芨[Bletilla striata（Thunb.） Reichb.f.]別稱冰球子、地螺絲、利知子、連及草等，為蘭科白芨屬多年生草本植物[1]，主要分布在我國秦嶺以南地域，多生長在潮濕的環(huán)境之中，作為我國一種傳統(tǒng)的中藥材[2]，具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌等功效，此外，白芨還是很好的黏合劑和食品增稠劑，白芨應(yīng)用廣泛[2-3]，因此，在市場呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的狀態(tài)，大量的人工采挖使得野生資源匱乏，于是出現(xiàn)了人工栽培，但在栽培過程中病害不斷發(fā)生，嚴(yán)重地影響了白芨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，最常見且危害最嚴(yán)重的真菌性病毒害包括白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑病菌。白芨根腐病主要侵染白芨的根部和葉片，造成根部軟化腐爛、葉片褪綠變黃，萎蔫死亡。白芨根腐病致使白芨大面積減產(chǎn)、質(zhì)量大幅度下降，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前控制白芨根腐病的主要方法仍以化學(xué)殺菌劑為主，但由于化學(xué)殺菌劑容易出現(xiàn)抗藥性和藥物殘留，不僅污染環(huán)境，還嚴(yán)重地威脅人體健康。隨著人們對(duì)無公害食品需求的日益增加以及對(duì)環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，生物防治成為了人們控制植物病害的理想途徑[4-5]。因此，篩選出生物活性高、抗菌譜廣的菌株具有重要的意義。目前國內(nèi)外對(duì)番茄[6]、黃瓜[4，6]等植物生物防治的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展[4]，但對(duì)白芨病害的生物防治還罕有報(bào)道。本研究從白芨根際土壤中進(jìn)行拮抗細(xì)菌和真菌的分離篩選，以4種常見的白芨致病菌為供試菌株，對(duì)所得菌株進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定，探討白芨根際土壤細(xì)菌和真菌對(duì)不同病原菌的拮抗作用，為解決白芨在栽培過程中的病害問題提供了初步的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣 供試土樣采自多年輪作無病害的白芨根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)采用肉湯（LB）培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、純凈水定容至1 000 mL。固體培養(yǎng)基中加瓊脂18.0 g，pH值為7.2。真菌培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15～20 g、自來水1000 mL。

1.1.3 供試菌株 白芨葉褐斑病病菌、葉斑霉病病菌、白芨塊莖腐爛病菌、白芨根腐菌均由陜西理工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 從陜西省漢中市白芨種植區(qū)挑選生長狀態(tài)好的白芨植株，采集其根際土壤，將土壤自然風(fēng)干后過20目篩，分別稱取5 g置于三角瓶中，加入45 mL無菌水及玻璃珠振蕩20 min得到土壤樣品懸液，依次用無菌水配制成5個(gè)濃度梯度的土壤懸液，每個(gè)梯度取100 μL均勻涂布在LB培養(yǎng)基表面，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，挑取性狀差異明顯的單菌落進(jìn)行編號(hào)，劃線法純化培養(yǎng)，4 ℃保藏備用。拮抗細(xì)菌分離采用LB培養(yǎng)基[7-8]，35 ℃培養(yǎng)3～5 d。拮抗木霉菌分離采用PDA培養(yǎng)基[9]，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，分離得到的拮抗菌株純化后，4 ℃保存。

1.2.2 抑菌活性的篩選 本試驗(yàn)以4種白芨致病菌為靶標(biāo)，采用菌餅法[7，10]篩選拮抗菌株。將預(yù)先培養(yǎng)好的白芨致病菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基中心，四周距平板邊緣1 cm處對(duì)稱接種拮抗菌株，每種處理3～5次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5～7 d[4，11]。拮抗細(xì)菌的篩選采用LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，看是否有抑菌圈的出現(xiàn)，并記錄對(duì)照及處理組白芨致病菌菌落直徑[2，12]，按公式計(jì)算抑制率：

菌絲生長抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.2.3 抗菌株的鑒定 對(duì)初步分離出來的白芨土壤根際細(xì)菌采用水煮法進(jìn)行DNA的提取、16S rRNA分子生物學(xué)鑒定[13]，本研究所用引物由康為世紀(jì)生物科技有限公司合成，引物序列E-27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[14]，應(yīng)用這2種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增長度大約為1 500 bp[15-16]。擴(kuò)增體系50 μL，包括：dNTP（4種核苷酸混合物）5 μL、E-27F和1492R 2種引物各2 μL，模板DNA（菌懸液）1 μL，DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40次循環(huán);72 ℃終延伸2 min;4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[17]。采用CTAB法用于真菌DNA的提取[18-19]，PCR擴(kuò)增體系：94 ℃預(yù)變性2 min;40個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）;72 ℃延伸2 min，4 ℃保存[20-21]，PCR反應(yīng)體系為10×Buffer（反應(yīng)緩沖液）5 μL、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP）5 μL，上下游引物ITS1、ITS4各2 μL，DNA模板1 μL、5 U/μL Taq 0.25 μL、ddH2O 34.75 μL，ITS序列長度都在500～750 bp之間[22]。該片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2的全部序列以及18S rDNA和28S rDNA的部分序列，將完成PCR擴(kuò)增的樣品再次進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳[23]，篩選出條帶明亮且清晰的樣品，將PCR送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)Blast分析，MEGA 6.0軟件分析序列同源性，以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]，Bootstrap（1 000次重復(fù)）進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株分離、純化結(jié)果

從白芨根際土壤中分離得到35株細(xì)菌和10株真菌，拮抗菌株篩選研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)白芨致病菌有抑菌活性的菌株共計(jì)14株（表1、表2）。其中，對(duì)白芨根腐菌有抑菌作用的菌株有14株，占拮抗菌總株數(shù)的100%;對(duì)白芨葉斑霉病病菌、白芨葉褐斑病病菌、塊莖腐爛病菌有抑菌作用的菌株9株，占拮抗菌總株數(shù)的64.29%。在上述14株具有抑菌效果的微生物菌株中，BJ-169、BJ-017、BJ-135、BJ-002、BJ1-07、BJ2-04對(duì)4種供試致病菌均有較好的抑菌活性。

2.2 拮抗菌株鑒定

8株拮抗細(xì)菌同源性分析結(jié)果（圖1）表明，菌株BJ-169芽孢桿菌Bacillus sp.（KX360745）的序列同源性高達(dá)100%，它們位于系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支上;綜合同源性比對(duì)結(jié)果，BJ-135屬甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）;BJ-175為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;菌株BJ-179與梭形芽孢桿菌Lsinibacillus sp.（MF784470）的序列同源性達(dá)100%;BJ-7屬于嗜氣桿菌屬Sporosarcina sp.（KY465523）;BJ-70燕麥屬Acidovorax sp.（KF999729）;菌株BJ-2與假單胞菌屬Pseudomonas sp.（KJ642347）;6株拮抗真菌綜合同源性比對(duì)結(jié)果（圖2），BJ2-4、BJ2-6與Aspergillus udagawae（LC317462）的同源性100%，它們位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，綜合同源性比對(duì)結(jié)果和BJ2-4、BJ2-6與曲霉在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌株應(yīng)屬于曲霉;BJ2-9與Trichoderma asperellum（MF808619）的序列同源性達(dá)到100%，它們位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上，綜合同源性比對(duì)結(jié)果和在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌株應(yīng)屬于剌孢木霉;菌株BJ2-3與Aspergillus tubingensis（MG647866）序列同源性達(dá)100%，綜合同源性比對(duì)結(jié)果和BJ2-3在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌應(yīng)屬于Aspergillus tubingensis;菌株BJ1-7與Penicillium oxalicum（MG543697）序列同源性達(dá)100%，綜合同源性比對(duì)結(jié)果和BJ1-7在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌應(yīng)屬于Penicillium oxalicum;菌株BJ1-2與Trichoderma effusum（MF040213、MF136544）序列同源性達(dá)100%，綜合同源性比對(duì)結(jié)果和BJ1-2在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌株屬木霉屬。

3 討論

從白芨根際土壤中分離得到35株細(xì)菌和10株真菌，其中對(duì)白芨致病菌有抑菌活性的菌株共計(jì)14株，這些菌株對(duì)白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑病菌以及白芨塊莖腐爛病菌都有不同程度的抑制作用，其中6種菌株對(duì)供試菌株都有拮抗作用，且抗菌活性較強(qiáng)。分別采用細(xì)菌16S rRNA和真菌18S基因序列對(duì)分離出的細(xì)菌和真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[11]，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌主要分布在芽孢桿菌屬中、真菌主要分布在木霉屬中，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是2011年才被鑒定的新種，劉利強(qiáng)等利用該菌種防治黃瓜灰霉病[8]?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的重要成員[25]，在防治傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品病害的同時(shí)，也逐漸用于人參病害生物防治。據(jù)已有的報(bào)道顯示，枯草芽孢桿菌廣泛應(yīng)用于植物根部[26]、枝干[27]、葉[28]、花部以及果蔬采摘后病害的防治方面，甚至用于人和動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防。因此，本研究首次從白芨根際土壤中分離得到的這2種芽孢桿菌可能與枯草芽孢桿菌[29]在一些生理活性上具有密切關(guān)聯(lián)性，比如它們的抑菌活性。除此之外，本研究中分離得到的芽孢桿菌屬中存在大量抑制白芨根腐病菌、葉斑霉病病菌、白芨葉褐斑病病菌以及白芨塊莖腐爛病菌的活性菌。目前，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為芽孢桿菌主要通過營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭、抗菌物質(zhì)產(chǎn)生、溶菌作用、誘導(dǎo)植物抗病性等方面來發(fā)揮其防病促生作用[30-31]。正是通過這些相關(guān)機(jī)制，芽孢桿菌殺菌劑對(duì)多種植物病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗作用，并同時(shí)具備環(huán)境兼容性好、抗逆性強(qiáng)、對(duì)人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[29]。因此，利用所獲得的具有抗菌活性的芽孢桿菌進(jìn)行深入研究、開發(fā)相關(guān)微生物菌劑是后續(xù)要進(jìn)行的重要工作之一。自發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)植物病原真菌有拮抗作用以來，科學(xué)家們從諸多方面開展了木霉菌的生防研究。由于木霉菌的拮抗作用具有廣譜性，目前已被認(rèn)為是用于植物病害生物防治最有潛力的生防菌之一。據(jù)已有研究報(bào)道，木霉對(duì)人參銹腐菌等引發(fā)的人參根部病害有較好的防治效果。丁萬隆等研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌劑可顯著降低西洋參立枯病的發(fā)病率[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，白芨根際病原菌受到木霉菌抑制后有明顯的生長停滯甚至萎縮現(xiàn)象，據(jù)已知木霉菌生防機(jī)制，推測可能是木霉菌生長速度快，對(duì)病原菌形成營養(yǎng)和空間的雙重競爭，使病原菌因缺乏營養(yǎng)和空間而萎縮;另外也可能是木霉對(duì)病菌菌絲的重寄生作用，導(dǎo)致病菌菌絲生長受到抑制。本試驗(yàn)篩選出的14株拮抗菌對(duì)4種白芨致病菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，證明其在白芨病害生物防治領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。后續(xù)將深入探索上述菌株對(duì)白芨致病菌的抑菌作用機(jī)制，結(jié)合田間病害防效測定，為白芨病害生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

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