曹志偉，陳紅英

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

免疫球蛋白（Igs）由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在脊椎動物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起重要作用。Ig分子由兩條重鏈（IgH）和兩條輕鏈（IgL）通過二硫鍵連接在一起，抗原結(jié)合位點(diǎn)位于IgH和IgL鏈的可變區(qū)。雖然魚類的免疫系統(tǒng)比較原始，但是，硬骨魚體內(nèi)產(chǎn)生的Ig包括IgM[1]、IgD[2-4]和IgT/IgZ[5，6]。在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮功能的免疫球蛋白主要是IgM[7]，哺乳動物體內(nèi)的IgM分子主要是以五聚體形式存在，而硬骨魚的IgM分子主要為四聚體[8]。IgD在體液免疫中發(fā)揮重要作用[9，10]，IgT 在粘膜免疫應(yīng)答中產(chǎn)生[11-13]。

抗體具有高特異性和高親和力，特異性的抗體已經(jīng)成為哺乳動物和脊椎動物免疫治療及免疫學(xué)和診斷學(xué)的重要工具[14]。迄今已開發(fā)出多種針對魚IgM的單克隆和多克隆抗體，如鯉Cyprinus carpio[15]、日本牙鲆Paralichthysolivaceus[16]和虹鱒Oncorhynchus mykiss[17]，用作這些魚類的免疫學(xué)研究工具。這些抗體可以檢測特定魚的IgM，但是，單獨(dú)開發(fā)用于檢測每個物種免疫應(yīng)答的抗體昂貴且耗時。為了降低成本和時間，本研究克隆和融合表達(dá)了鯽和虹鱒IgM的重鏈基因保守序列，用純化的融合蛋白制備兔抗血清，獲得了能同時用于特異性檢測鯽和虹鱒IgM的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽購自陜西臨潼區(qū)任留良友育種繁育場，虹鱒購自四川雅安貴特種水產(chǎn)經(jīng)營部；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、透析袋（直徑 27mm）、EL-TME顯色試劑盒（EL-TMB Chromogenic Reagent kit）和抗生素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB公司；DL2000 DNAmarker購自 Vazyme；2×Pfu MasterMix，化學(xué)發(fā)光試劑盒和HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG購自康為世紀(jì)；大腸桿菌Top10（Escherichia coli Top10）、大腸桿菌 BL21（DE3）和質(zhì)粒 pTriEx-1.1 皆由本實(shí)驗(yàn)室保存；2～3月齡新西蘭大白兔購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載鯽和虹鱒的IgM重鏈基因序列，它們的GenBank序列號分別為GU563725和S63348，利用生物信息學(xué)分析基因的保守結(jié)構(gòu)域，選定鯽IgM重鏈中的116～217位氨基酸序列和虹鱒 IgM重鏈中的135～235位氨基酸序列，優(yōu)化氨基酸的密碼子。將選定的鯽和虹鱒IgM重鏈保守區(qū)序列用Linker（Gly4-Ser）2連接，設(shè)計(jì)特異的引物（表 1），按照圖1中的策略通過重疊PCR合成基因序列，將合成的基因命名為JY-HZ-IgM。

1.3 重組質(zhì)粒pTriEx-JY-HZ-IgM的構(gòu)建

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切處理質(zhì)粒pTriEx-1.1和合成的JY-HZ-IgM基因片段，將雙酶切產(chǎn)物切膠回收后置于20℃連接1h。連接產(chǎn)物pTriEx-JY-HZ-IgM轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB（含有氨芐霉素）的平板上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，檢測正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證。

表1 引物的名稱和序列Tab.1 Name and sequences of the primers

圖1 JY-HZ-IgM片段合成策略Fig.1 Strategy for the JY-HZ-IgM fragment synthesis

1.4 融合蛋白JY-HZ-IgM的表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pTriEx-JY-HZ-IgM轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，然后將菌液涂在含有Amp的平板上，倒置，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到5mL液體培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖菌。當(dāng)菌液的OD600達(dá)0.7時，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)6h。吸取1mL培養(yǎng)好的菌液到1.5mL離心管中，8000r/min離心5min，棄上清收集菌體，將5mL的菌體全部收集。離心管中加入1mL的20mMTris-HCl緩沖液清洗菌體，8000r/min離心5min，棄上清收集菌體，清洗3次。清洗完的菌體沉淀中加入1mL20 mMTris-HCl（pH 7.9）緩沖液,放置在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中破碎，然后8000r/min離心10min。收集上清和沉淀，沉淀用1mL的20mMTris-HCl緩沖液重懸，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.5 融合蛋白JY-HZ-IgM的純化

包含pTriEx-JY-HZ-IgM質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3），按照 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接到 100mL 新鮮培養(yǎng)基中，37℃，250r/min過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中8000r/min離心15min，棄上清。菌體用20mMTris-HCl緩沖液清洗3次，加入20mL的Tris-HCl緩沖液重懸，然后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，8000r/min離心30min，棄上清，收集沉淀。加入20mL8M尿素溶液，4℃放置12h充分溶解。然后按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，把純化的蛋白溶液裝入透析袋中，在4℃下依次放置在4M、2M、1M和0M尿素溶液中透析，最后把透析過的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.6 融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清的制備

新購買的兔子在實(shí)驗(yàn)前先讓其適應(yīng)環(huán)境兩周，每天按時喂養(yǎng)。選擇A、B兩只兔子采用皮下六點(diǎn)免疫。首次免疫每只兔子注射200μg融合蛋白JY-HZ-IgM，蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化。第2～4次每次注射融合蛋白JY-HZ-IgM 100μg，蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，每次免疫間隔2周，一共免疫4次。免疫結(jié)束后一周心臟采血，37℃放置 1h，4℃靜置過夜，1500r/min離心5min，收集血清，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 兔抗JY-HZ-IgM血清效價的檢測

以融合蛋白JY-HZ-IgM作為抗原，采用間接ELISA測定抗血清的效價。用包被液將抗原JY-HZ-IgM稀釋到2μg/mL，然后把稀釋好的抗原加到酶標(biāo)板上，每孔50 μL，4℃過夜孵育。每孔加入200μLPBST放在搖床上清洗5min，重復(fù)清洗3次。每孔加入200μL封閉液，37℃放置2h。加入200μLPBST放在搖床上清洗5min，重復(fù)清洗3次。把抗血清按照1∶500、1∶2000、1∶8000、1∶32000、1 ∶128000、1∶512000、1∶2048000 和 1∶8192000 比例稀釋，陰性血清1∶500稀釋，然后按照順序加入到酶標(biāo)板中，37℃孵育2 h。加入200μL PBST放在搖床上清洗5min，重復(fù)清洗4次。加入100 μLHRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶10000 稀釋），37℃孵育 1 h。加入 200 μLPBST放在搖床上清洗5min，重復(fù)清洗4次。每孔加入100μL顯色液，避光反應(yīng)10 min，加入50 μL終止反應(yīng)液。把酶標(biāo)板放到多功能微孔板檢測儀檢測OD450。若實(shí)驗(yàn)組OD450等于或大于陰性對照2.1倍，即可判定為陽性，陽性血清最大稀釋倍數(shù)即為血清抗體的效價。

1.8 抗血清Western blot檢測

心臟采血分離的血清作為一抗，分別與融合蛋白JY-HZ-IgM、鯽血清和虹鱒血清做Western blot分析，檢測抗血清的結(jié)合效果。首先把融合蛋白JY-HZ-IgM、鯽血清和虹鱒血清通過SDS-PAGE分離。經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉后加入心臟采血分離的血清作為一抗。洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，洗膜。加入ECL顯色液，避光反應(yīng)3min，最后放在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS+）中檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 JY-HZ-IgM序列合成

分別選取鯽和虹鱒IgM重鏈保守區(qū)一個保守的結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，通過重疊PCR的方法克隆目的基因。將合成的片段JY-HZ-IgM用1%的瓊脂糖電泳凝膠檢測，預(yù)期片段大小為710 bp，檢測結(jié)果（圖2A）與預(yù)期相符，表明成功合成了JY-HZ-IgM片段。

2.2 重組質(zhì)粒pTriEx-JY-HZ-IgM檢測

平板上單菌落PCR檢測結(jié)果表明（圖2B），擴(kuò)增片段大小和預(yù)期相符（預(yù)期為710 bp）。提取質(zhì)粒后進(jìn)一步通過雙酶切檢測，酶切結(jié)果大小與預(yù)期相符（圖2C），最后送到北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建了pTriEx-JY-HZIgM質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmid

2.3 融合蛋白JY-HZ-IgM的表達(dá)檢測

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTriEx-JY-HZ-IgM轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，融合蛋白JY-HZ-IgM表達(dá)的可溶性分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，表達(dá)的融合蛋白在上清中含量很少，大部分都在沉淀中以包涵體形式存在。包涵體沉淀用8M尿素溶解后，用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化獲得融合蛋白JY-HZ-IgM（圖4），透析去除尿素后用分光光度計(jì)檢測可溶性的融合蛋白濃度為450μg/mL，純度在90%以上，達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清效價的測定

圖3 SDS-PAGE檢測融合蛋白JY-HZ-IgM表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE detection of the fusion protein JY-HZIgM expression

圖4 純化的JY-HZ-IgM蛋白檢測Fig.4 Detection of purified JY-HZ-IgM protein

圖5 抗血清效價檢測Fig.5 Detection of antiserumtiter

融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清效價的間接ELISA檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知，A兔和B兔抗血清的效價都很好，B兔抗血清的效價略高于A兔。其中A兔制備的抗血清稀釋2048000倍時OD450仍大于免疫前陰性血清的2.1倍，判定為陽性。B兔制備的抗血清稀釋8192000倍時OD450仍大于陰性血清的2.1倍，判定為陽性，表明制作的兔抗JY-HZ-IgM血清效價高于1∶2048000。

2.5 Western blot檢測抗血清的特異性

Western blot檢測制備的兔抗JY-HZ-IgM血清與JY-HZ-IgM蛋白特異性結(jié)合的結(jié)果見圖6。由圖6可知：蛋白條帶與預(yù)期大?。?5.3kDa）相符，制備的抗血清可以和JY-HZ-IgM特異結(jié)合（圖6，泳道1）。制備的抗血清與天然鯽血清、虹鱒血清進(jìn)行Western blot檢測，鯽的IgM單條重鏈約70kDa，天然（非還原）狀態(tài)下與輕鏈結(jié)合，以四聚體的狀態(tài)存在。還原和非還原狀態(tài)的Western blot檢測也表明，制備的抗血清可以識別還原和非還原狀態(tài)的鯽IgM（圖6，泳道2和3）。虹鱒IgM重鏈的理論大小為64.9 kDa，還原和非還原條件下Western blot檢測結(jié)果與預(yù)期相符（圖6，泳道4和5）。以上結(jié)果表明，制備的兔抗JY-HZ-IgM血清不僅能夠與融合蛋白JY-HZ-IgM特異性結(jié)合，還可以識別天然的鯽和虹鱒的IgM，因此制備的兔抗JY-HZ-IgM血清可以用來檢測鯽和虹鱒血清中的IgM。

圖6 用抗血清檢測鯽和虹鱒IgMFig.6 Detection of IgM of crucian carp and rainbow trout by antisera

3 討論

我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖歷史悠久，近年來水產(chǎn)品的產(chǎn)量持續(xù)穩(wěn)定增長，其中鯽和虹鱒的養(yǎng)殖占有重要地位。但是，隨著密度增大，水質(zhì)不斷惡化，養(yǎng)殖中細(xì)菌病和病毒病頻發(fā)。硬骨魚類的IgM是體內(nèi)含量最多的免疫球蛋白，在體液免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用[18]，在粘膜組織中具有較高的mRNA和蛋白水平。在寄生蟲、病毒或者細(xì)菌刺激魚體時，研究魚體內(nèi)的免疫球蛋白M的變化規(guī)律有助于改進(jìn)疾病的預(yù)防和治療措施。因此，研究魚類免疫球蛋白[19]及抗IgM的抗體的制備，可為魚類的免疫學(xué)研究提供檢測材料。

為了檢測鯽和虹鱒感染病毒后血清中IgM的變化量，本研究從NCBI獲取鯽和虹鱒IgM的重鏈序列，利用生物信息學(xué)分析序列的保守結(jié)構(gòu)域，人工合成鯽和虹鱒IgM的重鏈保守序列JY-HZ-IgM。把合成的JY-HZ-IgM片段克隆到pTriEx-1.1載體上進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果融合蛋白JY-HZ-IgM大部分以包涵體的形式存在。尿素使蛋白變性后用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，透析復(fù)性得到可溶的融合蛋白JY-HZ-IgM，濃度達(dá)到450μg/mL。本研究以純化的融合蛋白JY-HZ-IgM作為抗原制備了兔抗JY-HZ-IgM血清，利用間接ELISA測定了抗血清的效價，陽性血清稀釋2048000倍時OD450仍為陰性血清的2.1倍。為了檢測制備的抗血清的結(jié)合特異性，分別與融合蛋白JY-HZ-IgM、天然鯽血清和虹鱒血清進(jìn)行了Western blot檢測。據(jù)報道，硬骨魚的IgM重鏈為60～81kDa[20，21]，本實(shí)驗(yàn)中Western blot檢測的鯽和虹鱒IgM的大小相符，表明制備的抗血清可以與JY-HZ-IgM、天然鯽和虹鱒血清中的IgM特異性結(jié)合。因此，本實(shí)驗(yàn)中制備的兔抗JY-HZ-IgM血清可以用于檢測鯽和虹鱒的IgM在不同條件下表達(dá)量。

綜上所述，本研究成功合成了JY-HZ-IgM基因片段，表達(dá)、純化了鯽和虹鱒IgM重鏈的保守蛋白，制備了高效價的抗JY-HZ-IgM的兔抗血清，為進(jìn)一步研究鯽和虹鱒IgM在不同條件下的表達(dá)規(guī)律和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。