高婭北，婁曉平，陳二龍，張保全，張仲文，史久長，陳小翔，宋朝鵬*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市農(nóng)業(yè)路63 號 450002

2. 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州市中山南路77 號 310004

煙葉腐爛和霉變是烘烤過程中所發(fā)生的烤壞煙的常見類型，嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失，給煙葉生產(chǎn)帶來極大的影響［1-2］。因此，探究煙葉在烘烤過程中的腐爛和霉變發(fā)生規(guī)律及機(jī)制對提高烤煙產(chǎn)量及品質(zhì)具有重要意義。掃描電鏡具有高分辨率、視野范圍廣、富有立體感等特點，可用于觀測煙葉的變化。王亮等［3］通過掃描電鏡研究了煙梗和煙葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)；過偉民等［4］采用掃描電鏡觀測各部位煙葉微觀結(jié)構(gòu)的差異；寧敏等［5］通過該方法研究了再造煙葉的形貌結(jié)構(gòu)；陳二龍等［6］利用掃描電鏡分析了烘烤過程中霉變煙葉的組織微觀結(jié)構(gòu)，表明隨著烘烤時間的延長，主脈逐漸破損，異物逐漸增加，霉菌逐漸增多，至完全覆蓋于主脈端口，但異物的主要成分和含量尚不明確。能譜儀具有直觀呈現(xiàn)目標(biāo)元素含量及分布特征，且無損測定、分辨率高和測定速度快等特點，目前已廣泛應(yīng)用于煙葉成分的研究中，但主要集中在再造煙葉［7-10］和不同施肥量對煙葉元素含量與分配的影響方面［11］，而用于煙葉腐爛和霉變的研究較少。因此，采用掃描電鏡對腐爛和霉變煙葉主脈的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并采用能譜技術(shù)對主脈及其在腐爛和霉變過程中分泌異物的主要成分和含量進(jìn)行測定，旨在揭示烘烤過程中煙葉的腐爛和霉變機(jī)制，為防控?zé)熑~腐爛和霉變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017 年設(shè)置在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。供試品種為云煙85，土壤肥力均勻，適中，土壤pH 7.67，田間輸水系統(tǒng)通暢；按優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行大田管理和采收；采收煙葉為葉面積和葉色較為一致的中部（第9～11 片）適熟煙葉。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

參照陳二龍等［12］的方法將試驗煙葉放置于烘烤過程中易于發(fā)生腐爛和霉變的條件下烘烤（氣流上升式四層密集烤房頂層，相對濕度≥99.9%），參照三段式烘烤工藝進(jìn)行參數(shù)設(shè)定［13］。參考陳二龍等［6］的方法取烘烤前鮮煙葉和烘烤24 h 腐爛和霉變的煙葉，去除兩側(cè)葉耳，取主脈端口組織進(jìn)行樣品制備，用于掃描電鏡測試。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 掃描電鏡觀察和能譜檢測

取制備樣品，快速滴加數(shù)滴2.5%戊二醛固定液（4 ℃，由美國Alfa Aesar 公司生產(chǎn)的25%戊二醛配制而成），采用吉列雙刃刀片于載玻片上取1 mm厚度的煙葉主脈端口截面作為樣品，置于裝有2.5%戊二醛固定液的樣品瓶中。同時采用注射器抽取氣體，直至樣品下沉懸浮于固定液中。利用封口膜封口，在4 ℃條件下放置4 h，使樣品充分固定。用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PB, pH7.0）沖洗固定樣，1%的鋨酸溶液（美國Ted Pella 公司）進(jìn)一步固定樣品，經(jīng)乙醇系列脫水（國產(chǎn)無水乙醇配制成30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇溶液），臨界點干燥，噴金鍍膜，使用Quanta 200 掃描電鏡（荷蘭FEI 公司），于20 kV 條件下觀察樣品，采用X 射線光電子能譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定元素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［14-15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛和霉變煙葉特征分析

烤后腐爛和霉變的煙葉主要表現(xiàn)為葉基部腐爛呈褐色，且含有灰色的霉菌菌絲，但腐爛區(qū)域大于霉變區(qū)域（圖1A），與烘烤中煙葉腐爛和霉變的特點有關(guān)，見圖1B～F。煙葉在烘烤過程中，主脈端口首先產(chǎn)生褐變，隨后發(fā)生腐爛（圖1B）；煙葉主脈組織壞死為霉菌的生長繁殖創(chuàng)造了條件。因此，霉變首先發(fā)生在煙葉主脈端口（圖1C），煙葉腐爛區(qū)域的四周呈現(xiàn)放射狀，方向和位置與主支脈有關(guān)（圖1D）。煙葉霉變狀態(tài)與腐爛狀態(tài)相似，由端口向主脈、支脈以及向兩側(cè)有一定的擴(kuò)展（圖1E、F）。因此，煙葉腐爛發(fā)生時間早于煙葉霉變，煙葉腐爛和霉變均以主、支脈為主，然后向兩側(cè)擴(kuò)散，且煙葉腐爛擴(kuò)散速度大于霉變擴(kuò)散速度?？梢姡竞鬅熑~腐爛區(qū)域大于霉變區(qū)域。

2.2 腐爛和霉變煙葉主脈微觀結(jié)構(gòu)分析

鮮煙葉及烘烤過程中腐爛和霉變的主脈微觀結(jié)構(gòu)通過環(huán)掃電鏡觀測結(jié)果見圖2。烘烤前鮮煙葉主脈的薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，輪廓較為清晰，由表皮至中柱，細(xì)胞逐漸增大（圖2A）。在烘烤過程中，細(xì)胞壁被破損，且產(chǎn)生大量晶體，位于截面表層或細(xì)胞腔內(nèi)，部分晶體聚集成簇（圖2B）；煙葉主脈分泌的晶體多呈現(xiàn)四邊或五邊形，厚度為細(xì)胞壁的2 倍左右，晶體內(nèi)部具有規(guī)則的四邊形空隙結(jié)構(gòu)，且各空隙之間的間隔較為一致（圖2C）。霉菌菌絲生長于晶體上（圖2D）；此外隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損和晶體量的增加，霉菌大量生長繁殖，且菌絲具有分支（圖2E）。因此，煙葉腐爛發(fā)生先于煙葉霉變，且發(fā)生霉變的菌絲依附在晶體上。

2.3 腐爛和霉變煙葉能譜測定

圖1 烘烤期間煙葉腐爛和霉變特征Fig.1 Characteristics of mildew and rot of tobacco leaves during flue-curing

圖2 腐爛和霉變煙葉主要位置的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of main positions of moldy and rotten tobacco leaves

由于環(huán)掃電鏡觀察到霉變菌絲著生于煙葉主脈細(xì)胞所分泌的晶體上，因此，通過X 射線能譜儀分析主脈細(xì)胞和晶體的主要元素，結(jié)果見圖3 和表1。S1、S2 和S3 均含有Ca、Na 和O，但3 種元素含量存在較大差異，其中S1 的Na 和O 元素含量均最高，而S3 相應(yīng)的元素含量最低，但S3 的Ca 元素含量大于S1，而S2 介于兩者之間。除以上3 種元素之外，S1、S2 和S3 含有的元素種類存在差異。S1 檢測出C，未檢測出P；S3 檢測出P，未檢測出C；S2 含有C 和P。可見，晶體并非細(xì)胞壁的破損成分，而為烘烤過程中煙葉自身代謝的產(chǎn)物，且該產(chǎn)物具有一定的特異性。

圖3 不同測定點的能譜圖Fig.3 Energy spectrum of different measurement points

表1 不同測定點的主要元素含量Tab.1 Contents of main elements at different determination points （%）

3 討論

本研究結(jié)果表明，在烘烤過程中煙葉先腐爛、后霉變，這種變化規(guī)律與陳二龍等［6］的研究結(jié)果一致。原因可能是由于抗性較弱的組織易引發(fā)腐爛病原菌的入侵和擴(kuò)增，致使組織壞死，從而有助于霉菌入侵，并為霉菌的生長繁殖創(chuàng)造營養(yǎng)條件所引起的［16-18］；本試驗中，煙葉腐爛和霉變發(fā)生順序依次為主脈、支脈和葉片，這種變化規(guī)律可能與煙葉中的水分分布有關(guān)，因為植物組織含水率越高，越易發(fā)生腐爛和霉變［19-20］，而煙葉中含水率為主脈＞支脈＞葉片［21-22］，因此煙葉腐爛和霉變呈現(xiàn)該規(guī)律；烘烤過程中煙葉腐爛和霉變大部分只發(fā)生在煙葉的葉基部，部分蔓延至葉中部，但很少能蔓延至葉尖，這可能也是由于煙葉整體含水率表現(xiàn)為葉基＞葉中＞葉尖所引起的［23］。

煙葉主脈薄壁細(xì)胞中含有的一定量的草酸鈣砂晶［24］，具有解毒、防御和平衡離子的作用［25-26］。有研究表明，在一定條件下誘導(dǎo)特定時間即可在植物體內(nèi)合成草酸鈣砂晶，其形狀一般為針形、菱形片狀或是片形簇狀，元素組成為Ca、C 和O，多沉積在莖、葉主脈或葉肉細(xì)胞中［27-32］。本試驗條件下，烘烤過程中腐爛煙葉的主脈細(xì)胞中分泌出大量晶體，呈現(xiàn)清晰的菱形片狀，通過與前人對煙草中草酸鈣砂晶的研究結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)其形狀大小具有較高的相似度［33］；通過能譜檢測發(fā)現(xiàn)該晶體也含有大量Ca 和O 元素，其元素組成也與其他作物中的草酸鈣砂晶較為一致，且產(chǎn)生于主脈薄壁細(xì)胞中，與多數(shù)植物草酸鈣砂晶的沉積部位相同；因此推測該晶體為草酸鈣砂晶。由于該晶體出現(xiàn)于腐爛煙葉的主脈細(xì)胞中，且具有解毒、防御等作用，因此推測在本研究中煙葉主脈細(xì)胞分泌晶體這一行為是主脈在腐爛時自身機(jī)體為抵御病菌侵染、修復(fù)破損屏障的自體應(yīng)激反應(yīng)。在烘烤過程中霉變煙葉的霉菌菌絲著生于晶體上，可能是由于草酸鈣砂晶中含有大量的Ca 元素，而Ca 能夠促進(jìn)菌絲生長所引起的［34］。此外，該晶體含有一定量的P 元素，而P 具有抑制菌絲生長的作用［35］，與晶體促進(jìn)菌絲生長的結(jié)果相反，可能是由于P元素含量相對較低或不同種類霉菌抑制作用存在差異所致；除此之外，P 元素能以磷酸根的形式調(diào)控草酸鈣砂晶形貌和尺寸，從而避免晶體過大或濃度過高造成對植物的傷害［36］，因此煙葉主脈分泌的晶體中所含有的P 元素可在一定程度上調(diào)控晶體的尺寸和濃度，從而避免晶體的尺寸和濃度對煙葉造成不利影響。但目前有關(guān)腐爛煙葉主脈細(xì)胞草酸鈣砂晶的產(chǎn)生機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在烘烤過程中，煙葉腐爛發(fā)生時間、擴(kuò)散速度均先于霉變，且二者發(fā)生部位一致，均首先發(fā)生于主脈，而后向兩側(cè)葉肉延伸；煙葉腐爛時，主脈產(chǎn)生菱形片狀晶體，晶體中含有30.34%的Ca、44.40%的O、24.92%的P，以及0.34%的Na 元素，推測該晶體可能為草酸鈣砂晶，通過掃描電鏡觀察到煙葉霉變產(chǎn)生的霉菌菌絲著生于該晶體上?？梢姡瑹熑~霉變和腐爛主要發(fā)生在葉基部葉脈，煙葉腐爛產(chǎn)生的含Ca 草酸鈣砂晶促進(jìn)了煙葉霉變。