抗藥性木霉與原始木霉菌株抑菌活性差異

魯海菊 謝欣悅 張海燕

摘要：以分離自黃瓜中的3株內(nèi)生木霉（Trichoderma）（J1、J3、Y2菌株）為供試菌株，用含撲海因殺菌劑的PDA培養(yǎng)基篩選到4株抗藥性菌株（PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2）。測定其對枇杷根腐病病菌（Pestalotiopsis microspora）P3.1、P3.5、P3.6菌株、石榴枯萎病病菌（Ceratocystis fimbriata）SK菌株和萬壽菊葉斑病病菌（Alternaria brassicicola）WJ1菌株的抑制活性。結(jié)果表明，3株抗藥性木霉（PJ1-1、PJ1-2、PJ3）對供試的5株病原菌抑菌活性均高于其原始菌株（J1和J3），且抑菌率均高于50%;抗藥性菌株P(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株和石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率均極顯著高于原始菌株（Y2），對其余3株病原菌的抑制率低于原始菌株。說明PJ1-1、PJ1-2、PJ3等3株抗藥性木霉菌株與殺菌劑撲海因混配使用的前景廣闊，此結(jié)論可以為枇杷根腐病、石榴枯萎病及萬壽菊葉斑病綠色防控提供菌種資源和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：抗藥性木霉;撲海因;抑制作用;枇杷根腐病;石榴枯萎病;萬壽菊葉斑病

中圖分類號： S432.4+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0083-04

自2000年以來，云南省蒙自市石榴枯萎病[1]、枇杷根腐病[2]、萬壽菊葉斑病[3]發(fā)生普遍嚴(yán)重，亟需高效防治方法。石榴枯萎病和枇杷根腐病為土傳病害，化學(xué)防治土傳病害存在施藥困難、成本高、容易引起殘留及環(huán)境污染等問題。枇杷及石榴抗病育種工作目前相對滯后，在枇杷和石榴中尋找抗枇杷根腐病及石榴枯萎病的基因，成功培育出抗性品種，在短期內(nèi)難以實現(xiàn)。目前看來，生物防治是一種經(jīng)濟(jì)有效的控制土傳病害的方法。

木霉菌（Trichoderma）是當(dāng)前最有效且有巨大開發(fā)價值及潛力的生防菌。對多種植物病原菌表現(xiàn)拮抗活性[4]，并可用來防治部分土傳植物病害[5]。但是木霉生防制劑受田間不穩(wěn)定因素的影響較大、缺乏抗藥能力等缺陷，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用[6]。木霉成功定殖于植物根際土壤及其植株中，是木霉菌劑發(fā)揮生防作用的前提條件。而農(nóng)藥殘留是木霉成功定殖的限制因素之一。因此，篩選抗藥性木霉菌株尤為重要。筆者從3株黃瓜內(nèi)生木霉中，篩選獲得4株抗撲海因化學(xué)殺菌劑的木霉。為弄清抗藥性木霉的抑菌活性是否衰退，擬測定其對石榴枯萎病病菌、枇杷根腐病病菌和萬壽菊葉斑病病菌的抑菌活性，以期為云南省蒙自市3種重要植物病害的綠色防控提供生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 J1、J3、Y2均為內(nèi)生木霉菌株，分離自黃瓜的莖（J1和J3菌株）和葉（Y2菌株）。枇杷根腐病病菌（Pestalotiopsis microspora）（P3.1、P3.5、P3.6菌株）、石榴枯萎病病菌（Ceratocystis fimbriata）（SK菌株）、萬壽菊葉斑病病菌（Alternaria brassicicola）（WJ1菌株）分別分離自枇杷根腐病病株根莖韌皮部、石榴枯萎病病株枝干木質(zhì)部、萬壽菊葉斑病病葉。置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養(yǎng)基中低溫（4 ℃）保存，保存于云南省紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理教學(xué)實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖18.0 g、瓊脂13.5 g、蒸餾水1 000.0 mL;PDA含藥培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、撲海因100 mg、蒸餾水1 000 mL。上述培養(yǎng)基配好后均在121 ℃高壓滅菌30 min。馬鈴薯購自農(nóng)貿(mào)市場，葡萄糖、瓊脂、撲海因均購自云南科儀化玻有限公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗藥性菌株篩選 PDA培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至 45 ℃，加入100 mg/L撲海因后倒平板。將各供試木霉菌株在PDA培養(yǎng)基平板中，28 ℃恒溫擴(kuò)大培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，接種至PDA含藥平板中央。設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，接種不加藥的PDA培養(yǎng)基為對照。第7天觀察是否長菌落。

1.2.2 對峙培養(yǎng) 供試菌株擴(kuò)大培養(yǎng)及打取菌餅方法同“1.2.1”節(jié)中的方法，采用對峙培養(yǎng)法[7]，將木霉與病菌兩兩組合，同時接種于無菌PDA平板（直徑90 mm）中，2個接種點(diǎn)相距 45 mm，以不接種木霉菌株的PDA培養(yǎng)基作對照，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，第7天測定病菌的菌落直徑，計算其生長抑制率。

抑制率=[（dCK-dB）/dCK]×100%。

式中：dCK表示對照病菌菌落直徑;dB表示處理病菌菌落直徑。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始木霉與抗藥性木霉菌株菌落特征

木霉菌J1、J3、Y2菌株經(jīng)含撲海因殺菌劑PDA平板培養(yǎng)，獲得4株抗藥性木霉菌菌株，分別為PJ1-1、PJ1-2（J1的抗藥性菌株）、PJ3（J3的抗藥性菌株）、PY2（Y2的抗藥性菌株），抗藥性菌株比原始菌株的菌落顏色淺（圖1）。

2.2 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制作用

由表1可知，7個木霉菌株對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率差異極顯著（P<0.01）。抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率均高于57%，抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率略低于其原始菌株。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑菌活性未衰退。其中，PJ1-1和PJ1-2抗藥性菌株完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.1菌株，其上長出大量分生孢子，重寄生作用明顯強(qiáng)于原始菌株（圖2）。

2.3 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制作用

由表2可知，7個木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率差異極顯著（P<0.01）?？顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率均高于50%，抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株?？顾幮跃關(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率極顯著高于其原始菌株（P<0.01）。說明抗藥性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑菌活性未衰退。其中，PJ1-1抗藥性菌株的菌落完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.5菌株，其上長出大量分生孢子，重寄生作用明顯強(qiáng)于原始菌株（圖3）。

2.4 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制作用

由表3可知，7個木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率差異極顯著（P<0.01）?？顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率均高于60%，抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株?？顾幮跃關(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率低于其原始菌株，但產(chǎn)孢能力增強(qiáng)（圖4）。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制活性未衰退。其中，抗藥性菌株P(guān)J1-1完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.6菌株，其上長出大量分生孢子，重寄生作用明顯強(qiáng)于其原始菌株（圖4）。

2.5 各供試木霉菌菌株對石榴枯萎病病菌的抑菌作用

由表4可知，7個木霉菌菌株對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率差異極顯著（P<0.01）?？顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3的抑制率均高于71%，抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2菌株對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率極顯著高于其原始菌株（P<0.01）。說明抗藥性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制活性未衰退。其中，抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3的產(chǎn)孢能力有所下降（圖5）。

2.6 各供試木霉菌菌株對萬壽菊葉斑病病菌的抑菌作用

由表5可知，7個木霉菌菌株對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株均具有不同程度的抑制作用?？顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制率均高于62%，抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制率極顯著低于其原始菌株。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制活性未衰退。其中，PJ1-1和PJ1-2抗藥性菌株完全覆蓋萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株，其上長出大量分生孢子，重寄生作用明顯強(qiáng)于其原始菌株（圖6）。

3 結(jié)論與討論

抗藥性木霉菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對供試的5株病原菌抑菌活性均高于原始菌株J1和J3，其中，PJ1-1菌株完全覆蓋病原菌，其上產(chǎn)生大量分生孢子。說明其具有極強(qiáng)的重寄生能力，生防前景廣闊。前人曾研究獲得抗腐霉利[8]、抗苯菌靈[7]、多菌靈[9-10]、速克靈[11-12]、能降解敵敵畏[13]、毒死蜱和甲胺磷[14]等的抗藥性木霉菌菌株。但篩選獲得抗撲海因的木霉菌菌株尚屬首次。

我國化肥和農(nóng)藥過量施用現(xiàn)象較嚴(yán)重，由此引起環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等重大問題。農(nóng)作物綠色防控的呼聲越來越高。木霉與化學(xué)農(nóng)藥混配使用能大大降低化學(xué)農(nóng)藥施用量，有時還能發(fā)揮協(xié)同增效作用。例如，段銀芝等研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉、咪唑乙煙酸、咪唑煙酸等3種農(nóng)藥能促進(jìn)哈茨木霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢[15]。田連生等報道，木霉菌劑與多菌靈混配防治灰霉病有協(xié)同增效作用[16]。任鳳山等發(fā)現(xiàn)，木霉與幾種殺菌劑混配能增強(qiáng)對蘋果輪紋病的防治效果[17]。木霉菌 PJ1-1 菌株與撲海因混配施用， 防治石榴枯萎病、枇杷根腐病和萬壽菊葉斑病是否具有協(xié)同增效作用，有待進(jìn)一步研究。

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