殷少文 葉世蕓 王維

摘要：采用高效液相色譜法，研究不同生長(zhǎng)年限及炮制方式對(duì)黔產(chǎn)青錢柳中槲皮素和山柰素含量的影響，確定最佳的干燥溫度，考察種植年限對(duì)其品質(zhì)的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)，確定樣品處理?xiàng)l件為用80%甲醇回流1 h，4 mL鹽酸水解1 h。采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇：0.4%磷酸（65 ∶ 35），進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，在360 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下建立槲皮素和山柰素的含量測(cè)定方法，以槲皮素和山柰素含量的總和為指標(biāo)，確定最佳的干燥溫度和生長(zhǎng)年限。通過(guò)對(duì)樣品提取條件和色譜條件的優(yōu)化，槲皮素和山柰素分別在 3.12～99.8 μg/mL（r=0.999 8），3.23～103.4 μg/mL（r=0.999 9）內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，并且該方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠。對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類和方差分析，結(jié)果表明，青錢柳的最佳干燥溫度為70～80 ℃，生長(zhǎng)年限在3～5年內(nèi)，其成品性狀最佳。

關(guān)鍵詞：青錢柳;干燥溫度;生長(zhǎng)年限;槲皮素;山柰素;高效液相色譜

中圖分類號(hào)： S718.43 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0189-05

青錢柳[Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinsk.]系胡桃科（Juglandaceae）青錢柳屬（Cyclocarya Iljinsk.），別稱搖錢樹或青錢李，是我國(guó)特有的單種屬高大速生喬木[1]，于冰川世紀(jì)保存至今，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一。據(jù)《中國(guó)中藥資源紀(jì)要》記載，其樹皮樹葉具有清熱解毒、祛癰止痛之功效，其根、莖、枝均可入藥[2]。青錢柳以茶飲為現(xiàn)代的主要應(yīng)用方式。青錢柳茶是以青錢柳的初春嫩葉作為原料，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的炮制工藝制成的原葉茶形態(tài)的保健品。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉含多糖、三萜、酚酸、皂苷、黃酮等多種有效成分，同時(shí)還含有氨基酸、維生素、鍺、硒、鉻、釩、鋅、鈣等多種微量元素[3]，能夠增強(qiáng)人體免疫力，抗衰老抗氧化，特別適宜于現(xiàn)代三高類慢性疾病人群的飲用[4-7]。

青錢柳廣泛分布于我國(guó)貴州、云南、四川、湖南、湖北、福建等地。青錢柳是繼被人們譽(yù)為醫(yī)學(xué)界的第1棵樹——柳樹與第2棵樹——紅豆杉之后的醫(yī)學(xué)界第3棵樹，是大自然珍貴的寶藏[8]。在貴州省黔東南苗族侗族自治州地區(qū)，人們有長(zhǎng)期飲用青錢柳茶的習(xí)慣，其茶飲氣清香、色澤鮮亮呈淺紅棕色、味甘如飴，具有生津止渴，清熱解暑功效，當(dāng)?shù)厮追Q青錢柳為“甜茶樹”。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳中黃酮類化合物可清除人體內(nèi)自由基，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能等作用[9]，還具有抗油脂氧化活性，能降低三高發(fā)病率[10-11]，因而備受人們關(guān)注。青錢柳中黃酮類化合物是青錢柳的有效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，本研究通過(guò)探討生長(zhǎng)年限及干燥溫度對(duì)黔產(chǎn)青錢柳中黃酮類化合物含量研究的影響，為青錢柳產(chǎn)業(yè)化種植的采摘及加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜（Agilent型號(hào)：1260）;Agilent C18柱（規(guī)格：250 mm×4.6 mm，5 μm;型號(hào)：PN880975-902）;超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-100E）;鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：1122815404）;電子天平（瑞士梅特公司，型號(hào)：XS205）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：20160322）;山柰素對(duì)照（上海金穗生物有限公司，批號(hào)：20160113）;色譜級(jí)甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130410）;石油醚（重慶市川東化工有限公司，批號(hào)：20150901）;冰乙酸（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20161006）;乙腈（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20151014）;試驗(yàn)用純凈水。

所用青錢柳樣品采自黔東南苗族侗族自治州劍河縣雷山鎮(zhèn)八萬(wàn)山林場(chǎng)的不同生長(zhǎng)年限青錢柳，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院葉世蕓教授鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳[C. paliurus （Batal） lljinskaja]。將不同生長(zhǎng)年限新鮮青錢柳分別在陰干、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃條件下干燥。取干燥青錢柳用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩備用。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取槲皮素對(duì)照品10.87 mg和山柰素對(duì)照品 10.60 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合對(duì)照品溶液。可根據(jù)試驗(yàn)需求稀釋至各不同濃度。

1.4 供試品溶液的制備

取青錢柳粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL。密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液 25 mL，精密加入鹽酸4 mL后置90 ℃水浴中加熱水解1 h，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，即得。

1.5 色譜條件

色譜條件為：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇：0.4%磷酸（65 ∶ 35），進(jìn)樣量10 μL，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，理論塔板數(shù)按山柰素計(jì)算，不得低于4 000，2個(gè)成分與其他組分之間的分離度均大于1.50。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)與結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將供試品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在“1.5”節(jié)的色譜條件下進(jìn)行200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，以槲皮素和山柰素的峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明，360 nm 為最佳掃描波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 將保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子作為流動(dòng)相選擇的依據(jù)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，則可選擇流動(dòng)相有：甲醇 ∶ 0.2%磷酸體積比為55 ∶ 50、60 ∶ 40、65 ∶ 35，甲醇 ∶ 0.4%磷酸體積比為55 ∶ 45、60 ∶ 40、65 ∶ 35、70 ∶ 30。在流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中，調(diào)整甲醇和0.4%磷酸的體積比例，結(jié)果隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的降低，槲皮素和山柰素的保留時(shí)間延長(zhǎng)，并與雜質(zhì)峰的分離度增大。當(dāng)甲醇與0.4%磷酸的體積比為65 ∶ 35時(shí)，與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。為獲得好的分離效果和適宜的分離時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為甲醇 ∶ 0.4%磷酸（65 ∶ 35）。

2.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

影響樣品含量測(cè)定的因素有甲醇濃度、回流時(shí)間、鹽酸用量及水解時(shí)間，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)水平（表1），結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)方差分析結(jié)果，樣品處理因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度是甲醇濃度>回流時(shí)間>水解時(shí)間>鹽酸用量，并且甲醇濃度F=3.971，P=0.046<0.05，對(duì)結(jié)果有顯著性影響，其余因素的影響均不顯著。根據(jù)均值、極差和效應(yīng)曲線（圖3），選擇最優(yōu)的樣品處理?xiàng)l件：甲醇濃度為80%，回流時(shí)間為1 h，鹽酸用量4 mL，水解時(shí)間1 h。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

量取槲皮素和山柰素對(duì)照品母液，置于不同容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，各濃度見(jiàn)表3。按“1.5”節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出槲皮素回歸方程y=33 845x-0.967 7，山柰素回歸方程 y=37 834x+2.308 3，且槲皮素和山柰素分別在 3.12～99.8 μg/mL（r=0.999 8）、3.23～103.4 μg/mL（r=0.999 9）內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱取樣品適量，按“1.4”節(jié)方法處理樣品，按“1.5”節(jié)的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，分別于0、1、2、3、5、6、7、8、9、10 h 連續(xù)進(jìn)樣10次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4，槲皮素和山柰素的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是RSD=1.51%（n=10），RSD=0.81%（n=10）。結(jié)果表明，樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批藥材6份，每份約1.5 g，精確稱定，按“1.4”節(jié)方法處理樣品，按“1.5”節(jié)的色譜條件測(cè)定含量（表5），其槲皮素和山柰素平均含量值分別為0.156 4%和0.108 9%，RSD值分別為 1.53%、1.39%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精確吸取10 μL槲皮素和山柰素濃度分別為 0.021 74、0.021 2 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表6，其中槲皮素和山柰素峰面積的RSD值分別為0.17%和0.10%，表明儀器精密度良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

稱取同一樣品6份，分別精確加入2 mL 0.499 mg/mL 槲皮素和0.517 mg/mL山柰素，按供試品制備方法和色譜條件進(jìn)行操作，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見(jiàn)表7，通過(guò)加樣回收試驗(yàn)，回收率均在95%～105%的范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)過(guò)程可靠。

2.8 樣品的測(cè)定結(jié)果與分析

將備用的青錢柳樣品按“1.4”節(jié)方法處理后，按“1.5”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果（表9）表明，生長(zhǎng)年限F=39.192，P=0.000<0.01，干燥溫度F=14.133，P=0.000<0.01，所以生長(zhǎng)年限和干燥溫度對(duì)黔產(chǎn)青錢柳中黃酮類化合物的含量有顯著的影響。

基于不同干燥溫度下青錢柳中槲皮素和山柰素的總含量均值，采用系統(tǒng)分類的方法，對(duì)其干燥溫度進(jìn)行分類，結(jié)果見(jiàn)圖4，當(dāng)分為2類時(shí)，陰干、60 ℃、90 ℃、100 ℃為1類，70、80 ℃ 為1類。結(jié)合多重比較結(jié)果，低溫和高溫干燥對(duì)青錢柳的質(zhì)量均有影響。以同樣的方式對(duì)生長(zhǎng)年限進(jìn)行聚類分析，其結(jié)果無(wú)規(guī)律可尋，通過(guò)均值分析，青錢柳在3年、4年、5年時(shí)黃酮類化合物的含量較其他生長(zhǎng)年限高。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)，優(yōu)化了樣品處理的條件，通過(guò)對(duì)色譜條件的選擇，優(yōu)選測(cè)定條件，以保證測(cè)定結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)年限和不同干燥溫度的下的60份黔產(chǎn)青錢柳中槲皮素和山柰素的測(cè)定結(jié)果研究表明，生長(zhǎng)年限和干燥溫度都會(huì)對(duì)樣品的質(zhì)量產(chǎn)生顯著的影響。青錢柳的最佳干燥溫度為70～80 ℃，從本批樣品中可以得出，生長(zhǎng)年限在3～5年的青錢柳質(zhì)量較佳。在青錢柳炮制加工過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)期采摘的青錢柳，生長(zhǎng)年限越久，其葉片中木質(zhì)化部分越高，在加工的過(guò)程中容易碎裂，影響成品性狀。

通過(guò)對(duì)貴州省劍河縣青錢柳種植基地的考察發(fā)現(xiàn)，其加工方式為傳統(tǒng)的茶葉炮制工藝，由于工藝簡(jiǎn)單，效率低，造成很多青錢柳霉變，加工過(guò)程中葉片碎裂，造成資源的浪費(fèi)，并且炒制的過(guò)程中無(wú)溫度控制，本研究的目的旨在解決青錢柳炮制過(guò)程中溫度的控制。研究發(fā)現(xiàn)，高溫干燥效率高，但當(dāng)溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，產(chǎn)品顏色加深，容易烤焦，而且影響其黃酮類化合物的含量。低溫干燥的效率太低，由于所需時(shí)間太長(zhǎng)，造成青錢柳的霉變。對(duì)于生長(zhǎng)年限而言，青錢柳屬于多年生植物，在本批采樣中，生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)的葉片木質(zhì)化程度較高，顏色較深，造成這種現(xiàn)象的原因可能是樹木過(guò)于高大，下面葉片沒(méi)有得到充分光照，具體因素還有待研究。

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