李超 李誠 李春艷

摘要：擬建立小麥籽粒中脫落酸、生長素的快速提取方法和高效液相色譜（HPLC）法檢測2種激素的試驗體系。經(jīng)試驗對比，采用異丙醇、水、濃鹽酸體積比=2 ∶ 1 ∶ 0.002的混合溶液作為提取液，以二氯甲烷作為萃取溶劑，簡化了提取過程，提高了提取效率。HPLC的分離采用ZORBAXSB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）反相色譜柱，柱溫為 26 ℃，檢測器波長為262 nm，流動相為甲醇、乙酸水溶液（乙酸的體積分數(shù)為0.2%），其中甲醇、乙酸體積比=38 ∶ 62，流速為1 mL/min。結(jié)果表明，小麥籽粒中2種激素的分離效果較好，加標回收率達95.8%～96.6%，標準偏差在1.14%～1.59%之間。由此可見，該提取方法和檢測體系的建立為快速提取和檢測小麥籽粒中的脫落酸和生長素提供了可靠的方法。

關(guān)鍵詞：小麥;脫落酸;生長素;高效液相色譜

中圖分類號： S512.101 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0194-03

植物激素在植物生長發(fā)育及應對生物和非生物脅迫的反應中起著關(guān)鍵的作用[1-3]。小麥是我國重要的糧食作物，內(nèi)源性激素對小麥灌漿期籽粒的發(fā)育影響很大，會直接影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。因此，研究小麥內(nèi)源激素的變化，對于通過人工干預措施調(diào)控小麥生產(chǎn)具有重要的實踐價值?，F(xiàn)有的檢測植物內(nèi)源性激素的方法有生物鑒定法[6]、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、光譜和色譜法，其中色譜法包括氣相色譜法（GC）或與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法、高效液相色譜法（HPLC）或與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法、超高效液相色譜法等。生物鑒定法、光譜法和生物傳感器法因其專一性和局限性限制在近年來鮮有報道。間接酶聯(lián)免疫法因其使用方便、成本低、速度快而使其使用較為普遍，但靈敏度低，不能較好地滿足實際檢測需要[7]。氣相色譜法因大部分植物激素含有極性基團，不易揮發(fā)，需要進行衍生化處理才能測定[8]。高效液相色譜法不需要對激素進行衍生化處理，可直接進行測定，且準確性、靈敏度和重現(xiàn)性都比較好，是目前最常見的測定植物內(nèi)源性激素的方法?，F(xiàn)階段分析儀器已達到了較高的水平，相對于激素的檢測來說，樣品的前處理是整個檢測過程中的關(guān)鍵，冗長而復雜的前處理常常會造成樣品提取率低、雜質(zhì)干擾太大，從而導致試驗失敗。近年來，有較多學者對植物內(nèi)源性激素的提取做了研究，目前主要的提取方法是用80%甲醇過夜浸提[9]，但是提取時間過長（需要12 h以上），后續(xù)純化步驟過于繁瑣且需要大量的溶劑，成本較高。因此，改良前處理方法對植物內(nèi)源性激素的測定顯得尤為重要。本研究擬對比2種提取脫落酸和生長素的方法，優(yōu)化樣品前處理過程，以期為小麥籽粒內(nèi)源性激素的提取、測定提供一種簡便、高效、可行的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選擇新疆主栽冬小麥品種新冬22號為試驗材料，種子由石河子大學冬小麥課題組提供。試驗于2016—2017年在石河子大學農(nóng)學院試驗站（44°17N，86°03E，海拔461 m）進行。抽穗當天掛牌標記，開花當天選取同天開花、長勢一致的麥穗掛牌標記。分別于小麥開花后10、20、30 d取穗中上部籽粒，立即置于液氮中速凍5 min，再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試驗儀器：高效液相色譜儀（Agilent Technologies，Agilent 1260，USA）;冷凍離心機（Eppendorf，Centrifuge 5424，Germany）;氮吹儀（Organomation，N-EVAP-45，USA）;臺式恒溫搖床（NEW BRUNSWICK，Innova 40 R，UK）;紫外分光光度計（HITACHI，U-5100，Japan）;電子天平（Sartorius，BS 210 s，Germany）。

生長素（IAA）、脫落酸（ABA）標準品，均購于Sigma公司;甲醇（流動相）為色譜純，購于Fisher公司（美國）;色譜純冰乙酸，購于天津光復精細化工研究所;甲醇（提取液）、石油醚、乙酸乙酯為國產(chǎn)分析純;超純水為筆者所在實驗室自制。

1.2 激素提取方法的建立

方法1：激素的提取參考Wu等的方法[10]并作適當修改后進行：準確稱取4 g用液氮研磨的小麥籽粒粉末，加入 16 mL 提取緩沖液（樣品與提取緩沖液體積比保持1 ∶ 4，以體積比為2 ∶ 1 ∶ 0.002的異丙醇、水、濃鹽酸溶液為提取緩沖液，以0.001 mol/L丁基化羥基甲苯作為抗氧化劑），于4 ℃、200 r/min振蕩30 min。再加入32 mL（提取緩沖液體積的2倍）二氯甲烷，于4 ℃、200 r/min振蕩30 min。之后于4 ℃、 12 000 r/min 離心10 min，取下清液，在避光條件下用氮氣吹干，加甲醇定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，上HPLC分析。

方法2：準確稱取4 g用液氮研磨后的小麥籽粒粉末，加入10 mL預冷的80%甲醇溶液，振蕩搖勻后置于4 ℃冰箱過夜;浸提過夜后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min得上清液，將殘渣加入10 mL 80%甲醇中浸提3 h，該步驟重復2次后合并上清液。將合并后的上清液用氮吹儀濃縮至原體積的1/3，加入30 mL石油醚萃取脫色3次，棄上清。再用20 mL乙酸乙酯對水相溶液萃取3次，合并酯相后用氮吹儀吹干。用pH值為3.5的乙酸水溶液溶解，溶液過預處理后的Sep-Pak C18小柱純化，用甲醇洗脫（之后發(fā)現(xiàn)二氯甲烷的洗脫效率更高，遂改為二氯甲烷洗脫）。將洗脫液在避光條件下用氮氣吹干，用甲醇定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，上機分析[9]。

1.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAXSB-C18（150 mm×4.6 nm，5 μm，Agilent公司），流動相A為甲醇，B為乙酸水溶液。流速為 1 mL/min，柱溫為26 ℃，檢測器波長為262 nm，進樣量為10 μL。

1.4 標準溶液的配制

用甲醇（色譜純）將生長素、脫落酸標準品配制成濃度為 1 mg/mL 的母液，根據(jù)出峰情況逐級稀釋作標準曲線。

1.5 樣品加標回收率的測定

取小麥籽粒（花后20 d）并用液氮研磨，將研磨后的小麥粉分為4份，每份4 g;取2份小麥籽粒樣品，其中1份加入 5 000 ng 標準樣品，同時用第1.2節(jié)中的方法1進行激素的提取;對于剩余的2份樣品按照第1.2節(jié)中的方法2進行樣品的加標回收率測定，試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

用紫外分光光度計對激素混合標準品溶液進行掃描，同時兼顧2種激素的分離效果。分析發(fā)現(xiàn)，溶液在262 nm處有最大吸收波長，且2種激素在262 nm檢測波長下均有較好的峰形，故選擇在262 nm波長下對樣品的標準品溶液進行測定。

2.2 流動相配比

參考前人以甲醇、水作為流動相進行的激素分離研究，分別以體積分數(shù)為60%、50%、40%、30%、20%的甲醇作為流動相對標準品進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當甲醇含量為40%、30%時，2種激素能夠與雜質(zhì)分離。隨即進行微調(diào)，發(fā)現(xiàn)當甲醇含量為38%時，2種激素的分離效果顯著。

2.3 流動相pH值

由于目標激素均為弱酸性樣品，因此通過調(diào)節(jié)流動相pH值可以抑制樣品的解離，以增加樣品組分在固定相上的保留時間，改善峰形。分別在水相（總體積為1 L）中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mL冰乙酸，發(fā)現(xiàn)當加入2 mL冰乙酸時，2種激素峰形尖銳且各組分的分離效果較好。因此，采用體積分數(shù)為0.2%的乙酸水溶液作為流動相。

2.4 流速和柱溫

分別檢測不同流速（0.4、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0 mL/min）下2種激素的分離效果，發(fā)現(xiàn)流速過大時，各激素峰分離差，容易出現(xiàn)肩峰;流速過小時，整個分離過程的時間大大增加。綜合考慮，選用1.0 mL/min的流速。試驗還發(fā)現(xiàn)，柱溫對整個檢測過程的影響較小，故選擇室溫為26 ℃。

選擇最優(yōu)色譜條件，對2種激素的混合標樣進行檢測。從圖1可以看出，2種激素的分離和檢測結(jié)果良好。

2.5 標準曲線及其線性范圍

在“1.3”節(jié)的色譜條件下，以峰值面積為縱坐標、標品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算各激素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍。表1結(jié)果顯示，激素標準品濃度與峰面積的線性相關(guān)性均達到極顯著水平。

2.6 實際樣品測定和樣品加標回收率

如表2所示，在樣品加標回收率測定中，使用方法1提取得到的樣品含量極顯著高于方法2得到的樣品含量，方法1的樣品加標回收率也顯著高于方法2的樣品加標回收率。激素的提取通常使用的是相似相溶原理，現(xiàn)階段常用的激素提取方法是用80%甲醇于4 ℃過夜浸提[11-13]，如簡利茹等用乙腈和水按一定比例混合后提取菌液中的植物激素[14]，劉同祥等用純乙腈提取辣椒幼苗中的植物激素[15]，馬宏棋等用一定比例的甲醇、乙酸乙酯和甲酸提取草莓中的脫落酸[16]。這些方法雖然能夠從植物組織中有效地提取出植物激素，但是后續(xù)步驟過于繁瑣，需要大量的時間和溶劑，且成本較高。本研究通過不斷試驗，以異丙醇、水、濃鹽酸溶液（異丙醇、水、濃鹽酸體積比為 2 ∶ 1 ∶ 0.002）作為提取液并加入丁基化羥基甲苯作為抗氧化劑防止激素氧化分解，經(jīng)過短時間的振蕩后用二氯甲烷萃取就可以得到目標激素，大大節(jié)省了時間和成本。通過2種提取方法的對比，本研究采用的方法在提取率上優(yōu)于將80%甲醇作為脫落酸和生長素的提取方法，此方法簡化了后續(xù)處理步驟，大大減少了目標激素的損失。

2.7 小麥籽粒不同發(fā)育時期的激素含量

如圖2所示，小麥籽粒中的2種激素得到良好的分離，與方法2相比， 用方法1提取的樣品雜質(zhì)峰相對較少。采用方法1建立的快速提取方法及第1.3節(jié)的色譜條件測定小麥花后10、20、30 d籽粒中的激素含量。檢測結(jié)果顯示，花后10、20、30 d籽粒中IAA的鮮質(zhì)量含量分別為1 382、412、267 ng/g，ABA的鮮質(zhì)量含量分別為283、922、475 ng/g。IAA是高等植物體內(nèi)主要的細胞分裂素之一，花后10 d左右是小麥胚乳細胞增殖時期，這個時期較高含量的IAA有助于胚乳細胞快速增殖，以增加籽粒的庫容量[17];花后20 d是小麥籽粒灌漿的高峰時期，這個時期ABA含量比較高，這是由于籽粒中的ABA能夠控制籽粒的成熟，提高籽粒灌漿速率[4，18]。

3 結(jié)論

通過2種激素提取方法的比較，本研究建立了1種簡單、快速、高效提取小麥籽粒中脫落酸、生長素的方法和HPLC檢測條件。本研究建立的提取方法，能夠滿足對小麥籽粒中脫落酸和生長素定量分析的要求，為進一步研究脫落酸和生長素對小麥籽粒發(fā)育的影響提供了基礎(chǔ)，也為其他植物樣品激素的提取提供了參考。

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