孫曼鈺 李棟梁 舒月力

摘要：以尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，探究其誘導(dǎo)產(chǎn)酶及同步糖化發(fā)酵產(chǎn)纖維素乙醇的影響。選取不同誘導(dǎo)底物、產(chǎn)酶培養(yǎng)基以及發(fā)酵時(shí)間，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中羧甲基纖維素酶活性和木聚糖酶活性，確定最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件。最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：底物30 g/L，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨3 g/L，pH值6.0。最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶的底物為小麥秸稈，發(fā)酵4 d羧甲基纖維素酶活性達(dá)到12.40 U/mL，木聚糖酶活性達(dá)到 930.9 U/mL。尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)所產(chǎn)纖維素酶具有較好的pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，在一定程度上能彌補(bǔ)真菌纖維素酶耐堿性差和細(xì)菌纖維素酶活性低的不足。將其作為乙醇發(fā)酵菌種進(jìn)行木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵，在3%葡聚糖負(fù)荷下，96 h生成乙醇12.23 g/L，乙醇得率為71.81%。將其與釀酒酵母混菌同步糖化發(fā)酵，48 h添加木糖利用率最高，96 h生成乙醇19.11 g/L，乙醇得率82.11%。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌;纖維素酶;同步糖化發(fā)酵;乙醇

中圖分類號(hào)： S188+.4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0277-05

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，占地球總生物量的40%左右，高效、廉價(jià)地利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為如燃料乙醇等化工產(chǎn)品，是由石油基向生物基經(jīng)濟(jì)社會(huì)轉(zhuǎn)型的基礎(chǔ)[1]。木質(zhì)纖維素的主要成分是纖維素、木質(zhì)素、半纖維素。在植物組織中木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，并將纖維素分子包埋其中，形成一種堅(jiān)固的天然屏障[2]。

纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為寡糖和纖維二糖并最終水解為葡萄糖的多組分酶系，廣泛存在于自然界的生物如真菌、細(xì)菌、少數(shù)動(dòng)物體內(nèi)，不同微生物所產(chǎn)纖維素酶系組成差別較大：木霉纖維素酶的β-葡萄糖苷酶活性較低，而黑曲霉纖維素酶的外切葡聚糖酶活性較低[3]。尖孢鐮刀菌具有較高的纖維素酶產(chǎn)量，而且前人對(duì)其纖維素分解系統(tǒng)的各個(gè)成分有較具體的研究[4]。同時(shí)，尖孢鐮刀菌也是一種能夠利用己糖和戊糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的絲狀真菌。此外，它能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，使之能夠在深層液體或者固態(tài)培養(yǎng)條件下附著在木質(zhì)纖維素底物上。尖孢鐮刀菌的強(qiáng)致病性與其所產(chǎn)纖維素酶有密切關(guān)系。由于植物病原菌通過(guò)滲入外細(xì)胞層和侵入不同的植物組織而感染宿主，感染期間病原菌會(huì)完全破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中纖維素等多聚物，對(duì)纖維素降解能力很強(qiáng)，因此對(duì)該菌纖維素降解系統(tǒng)的研究最初是基于防治的目的。隨著研究的深入，尖孢鐮刀菌的高產(chǎn)纖維素酶的性能逐漸被認(rèn)識(shí)，其所產(chǎn)纖維素酶為胞外酶，且酶系完全[5]。纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程包括原料預(yù)處理、發(fā)酵過(guò)程2個(gè)階段，原料主要包括麩皮、秸稈、酒糟、廢紙漿等[6]。在進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，選擇合適的發(fā)酵原料很關(guān)鍵。纖維素酶是誘導(dǎo)酶，碳源對(duì)菌種的產(chǎn)酶能力影響特別大。同時(shí)，培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)酶能力也有影響。

同步糖化發(fā)酵（simultaneous sacchrification and fermentation，SSF）采用纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行水解，同時(shí)加入乙醇發(fā)酵菌，使水解與發(fā)酵在同一反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行，且酶水解過(guò)程中得到的糖類能迅速被微生物利用生產(chǎn)乙醇。由于酶解過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖和纖維二糖會(huì)很快積累，會(huì)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生非常顯著的終端產(chǎn)物反饋抑制作用，抑制酶解，使得最終的糖的轉(zhuǎn)化率降低。同步糖化發(fā)酵可以消除纖維素酶受葡萄糖和纖維二糖的終產(chǎn)物抑制，提高纖維素酶解的效果并能降低酶制劑的用量，具有染菌風(fēng)險(xiǎn)小、轉(zhuǎn)化率高、獲得乙醇濃度較高等優(yōu)點(diǎn)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料、試劑與儀器 檸條錦雞兒（以下簡(jiǎn)稱檸條）采自內(nèi)蒙古涼城縣，小麥秸稈采自山東省棗莊市;水稻秸稈采自湖南省永州市。試驗(yàn)地點(diǎn)為天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，試驗(yàn)時(shí)間為2017年3—4月，主要試劑包括羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、蛋白胨、酵母提取物、檸檬酸、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銨、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水乙醇。主要儀器：微型植物粉碎機(jī)（DF-15），購(gòu)自溫嶺市林大機(jī)械有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠;循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;水分儀（MJ33），購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司;高效液相色譜（1260LC），購(gòu)自安捷倫科技（中國(guó)）有限公司;恒溫水浴鍋（HH-2），購(gòu)自常州市凱航儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（DH-101），購(gòu)自天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;超凈工作臺(tái)（VS-1300L-U），購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWYR-D2401），購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;水浴振蕩器（HZS-H），購(gòu)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;精密電子天平（MS204S），購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司;pH計(jì)（Delta 320），購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 尖孢鐮刀菌菌種由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院應(yīng)用微生物與酶工程實(shí)驗(yàn)室提供;酵母由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，若制固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L，不調(diào)節(jié)pH值。酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L，若制固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L，不調(diào)節(jié)pH值。發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基A：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨 3 g/L，pH值6.0。發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基B：底物 40 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，氯化鈣0.3 g/L，硫酸鎂 0.3 g/L，磷酸氫二銨 10 g/L，磷酸二氫鈉6.94 g/L，磷酸氫二鈉9.52 g/L，pH值 6.0。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的確定 在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養(yǎng)4 d，平板中長(zhǎng)出的菌絲接種PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d，得到菌液。取3 mL菌液分別轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基A和B，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)后3、4、5 d分別取發(fā)酵液12 000 r/min離心20 min，上清即為粗酶液。

1.2.2 尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶誘導(dǎo)底物的確定 選取3種誘導(dǎo)底物，分別為檸條、麥稈和水稻秸稈。以上原料自然風(fēng)干，剪成2～3 cm小段，用植物試驗(yàn)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20 mm篩。用于成分分析的秸稈原料在空氣中干燥至水分低于10%。

在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養(yǎng)4 d，平板上長(zhǎng)出的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng) 2 d，得到菌液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基A，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)后3、4、5 d分別取發(fā)酵液12 000 r/min離心20 min，上清即為粗酶液。

1.2.3 尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間的確定 在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養(yǎng)4 d，平板中長(zhǎng)出的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)2 d，得到菌液。取3 mL菌液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基A，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)后3、4、5 d分別取發(fā)酵液12 000 r/min離心 20 min，上清即為粗酶液。

1.2.4 酶活性的測(cè)定 酶活性定義[8]：在50 ℃、pH值4.8條件下，1 min內(nèi)由1 mL酶解液催化底物水解生成1 μg葡萄糖（木糖）所需的酶量，定義為1個(gè)酶活性單位，以U/mL表示。

CMC-Na酶活性測(cè)定：于試管中加入2 mL由pH值為4.8的檸檬酸緩沖溶液配制的1% CMC-Na，預(yù)熱5 min，再向試管中加入0.5 mL粗酶液，對(duì)照管中加入底物作空白對(duì)照。50 ℃水浴30 min，向試管和對(duì)照管中分別加入3 mL DNS，沸水浴10 min，迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，混勻，于540 nm下測(cè)吸光度。酶活計(jì)算公式如下：

x=D×（1/0.5）×n×2。

式中：X為羧甲基纖維素（還原糖）酶活性，U/mL;D為吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖量，mg;1/0.5為換算成酶液 1 mL;n為酶樣的稀釋倍數(shù);2為時(shí)間換算系數(shù)。

木聚糖酶活性測(cè)定[9]：與CMC-Na酶活性測(cè)定過(guò)程基本相似，將底物換成木聚糖，檸檬酸緩沖液換成pH值為4.4的乙酸-乙酸納緩沖液。于試管中加入2 mL由pH值為5.5的乙酸-乙酸納緩沖液配制的1%木聚糖，預(yù)熱5 min，再向試管中加入2 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，對(duì)照管中加入底物作空白對(duì)照。40 ℃水浴30 min，向試管和對(duì)照管中分別加入5 mL DNS，沸水浴10 min，冰浴5 min，定容至25 mL，混勻，于 540 nm 處測(cè)吸光度。酶活計(jì)算公式如下：

xD=（Da-Db）×K+C0M×t×1 000;

x′=XD×Dt。

式中：xD為稀釋酶液中木聚糖酶的活性，XD值應(yīng)在0.04～0.10 U/mL 之間;Da為酶反應(yīng)吸光度;Db為酶空白樣吸光度;K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;C0為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距;M為木糖的摩爾質(zhì)量;t為酶解反應(yīng)時(shí)間，min;1 000為轉(zhuǎn)化因子，1 mmol=1 000 μmol;x′為試樣中木聚糖酶的活力，U/mL;Dt為試樣稀釋倍數(shù)。

1.2.5 同步糖化發(fā)酵 尖孢鐮刀菌不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)酶，還可以用來(lái)進(jìn)行木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵。將麥稈與 0.5 mol/L NaOH溶液按料液比1 ∶ 20（g ∶ mL）混合，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃預(yù)處理1 h，固體殘?jiān)粗林行?，烘干，粉碎，過(guò) 20 mm 篩。將上述經(jīng)NaOH處理后的物料按30 mg/mL葡聚糖固體負(fù)荷進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，反應(yīng)體積為100 mL。纖維素酶（celluclast） 1.5 L和β-葡萄糖苷酶用量按照25 FPU/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10 mg/g葡聚糖加入酶體系中，于50 ℃、200 r/min下預(yù)酶解6 h。

將酵母接種的時(shí)間定義為同步糖化發(fā)酵開始起點(diǎn)，按照5%接種量將尖孢鐮刀菌種子液接入降解液中，于35 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)120 h。在接種后6、12、24、48、72、96、120 h取樣，樣品12 000 r/min下離心5 min，取上清，用高效液相色譜法測(cè)葡萄糖、木糖和乙醇含量。所使用的色譜柱為Aminex HPX-87P（Bio-Rad）有機(jī)酸分析柱，5 mmol/L稀硫酸為流動(dòng)相，使用前經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣30 min。測(cè)定時(shí)柱溫60 ℃，流速0.6 mL/min[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶誘導(dǎo)底物和培養(yǎng)時(shí)間的確定

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，碳源對(duì)菌種的產(chǎn)酶能力影響很大，不同碳源對(duì)纖維素酶的合成有不同的誘導(dǎo)作用，一般天然纖維素原料更有利于纖維素酶的合成。選取水稻秸稈、小麥秸稈和檸條為尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)底物，分別在發(fā)酵后3、4、5 d取樣測(cè)定其羧甲基纖維素（CMC）酶活性和木聚糖酶活性。由圖1可知，木本植物檸條誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果遠(yuǎn)不如草本植物水稻和小麥秸稈。發(fā)酵后4 d水稻秸稈和小麥秸稈的CMC酶活性是檸條的10倍，木聚糖酶活性在300～931 U/mL之間，高于檸條，同時(shí)也高于其他文獻(xiàn)研究。葛春輝等從垃圾堆肥中分離出能用羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的降解菌，能產(chǎn)生胞外纖維素酶，最佳酶活僅達(dá)到376 U/mL[11]。這是由于不同植物種類中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的分布和含量不一樣。木本類植物具有較高的纖維素和木質(zhì)素含量，纖維素以微纖維形式存在，纖維素鏈之間氫鍵相互連接[12]。木質(zhì)素纏繞在纖維素周圍，且與半纖維素成分緊密相連，共同維持著纖維素的完整性及結(jié)構(gòu)的剛性，這種結(jié)構(gòu)阻礙了微生物與纖維素的接觸。草本類植物中的半纖維素含量較高[13]，內(nèi)部纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)相對(duì)較疏松，所以誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果優(yōu)于木本植物。

對(duì)于尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶而言，無(wú)論是CMC酶活性還是木聚糖酶活性都是發(fā)酵后4 d遠(yuǎn)高于發(fā)酵后3、5 d。

2.2 尖孢鐮刀菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的確定

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，碳源對(duì)菌種的產(chǎn)酶能力影響特別大。同時(shí)，培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間的選擇對(duì)菌種產(chǎn)酶能力也有影響。如圖2所示，分別選取水稻秸稈和小麥秸稈為底物，選取A、B、C 3種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在發(fā)酵后4 d取樣測(cè)其CMC酶和木聚糖酶活性。水稻和小麥秸稈誘導(dǎo)下A培養(yǎng)基CMC酶活分別為12.40、10.82 U/mL，木聚糖酶活為930.92、311.49 U/mL;而B培養(yǎng)基中CMC酶活為2.41、3.43 U/mL，木聚糖酶活為158.86、78.65 U/mL;C培養(yǎng)基中CMC酶活為6.23、5.64 U/mL，木聚糖酶活為423.65、145.78 U/mL。本試驗(yàn)所用3種培養(yǎng)基所產(chǎn)纖維素酶活都要高于其他文獻(xiàn)報(bào)道。其中，2種底物誘導(dǎo)下A培養(yǎng)基產(chǎn)酶效果都要優(yōu)于B、C 2種培養(yǎng)基，由于A培養(yǎng)基中氮源含量高于B種培養(yǎng)基，豐富的氮源有利于尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，同時(shí)有利于其產(chǎn)酶。

對(duì)于同是草本植物的水稻秸稈和小麥秸稈，水稻秸稈誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于小麥秸稈。同時(shí)，尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶具有較好的pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，尤其對(duì)強(qiáng)堿環(huán)境的耐受力在一定情況下彌補(bǔ)了真菌纖維素酶耐堿性差和細(xì)菌纖維素酶活力不足等缺點(diǎn)。因此，該菌有進(jìn)一步研究的意義。

2.3 尖孢鐮刀菌同步糖化發(fā)酵

根據(jù)再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）2步酸水解法對(duì)未處理小麥秸稈和堿處理小麥秸稈進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明，纖維素含量由32.73%增加到62.81%，半纖維素含量由22.18%變?yōu)?2.66%。經(jīng)過(guò)NaOH預(yù)處理后，小麥秸稈中纖維素和半纖維素的含量明顯升高，木質(zhì)素含量明顯降低，表明NaOH預(yù)處理去除了秸稈中的大量木質(zhì)素，從而使得纖維素和半纖維素比例相對(duì)升高。有效的預(yù)處理方式能提高剩余多聚糖的酶可及性及可利用糖的濃度，從而最終提高乙醇產(chǎn)量[14]。

圖3-a為尖孢鐮刀菌同步糖化發(fā)酵葡萄糖利用情況，與傳統(tǒng)發(fā)酵菌釀酒酵母相比較，0～12 h內(nèi)釀酒酵母迅速利用葡萄糖，12 h后基本利用完全;尖孢鐮刀菌試驗(yàn)組原料繼續(xù)酶解，葡萄糖濃度增加;12～48 h，尖孢鐮刀菌開始利用葡萄糖，但是相比于釀酒酵母，其利用周期較長(zhǎng)，利用速率較慢;48～96 h基本趨于平穩(wěn)。

如圖3-b所示，尖孢鐮刀菌對(duì)于2種菌的木糖利用率稍高于釀酒酵母。釀酒酵母基本上不利用木糖，釀酒酵母作為傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株具有耐受能力強(qiáng)、不易染菌等優(yōu)點(diǎn)，但是天然的釀酒酵母不具有木糖代謝能力，木糖發(fā)酵是利用纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)之一[15]。24～48 h內(nèi)尖孢鐮刀菌試驗(yàn)組木糖濃度由12 h的12.78 g/L降低到6 g/L左右，48 h后基本趨于平穩(wěn)。但是2種菌的木糖利用率都較低，五碳糖與六碳糖的共利用是目前同步糖化發(fā)酵存在的最大問(wèn)題。對(duì)于木糖的利用，目前最常見的手段是通過(guò)人工構(gòu)建木糖代謝途徑和構(gòu)建可以利用木糖的基因工程釀酒酵母[16]。但研究者發(fā)現(xiàn)，即使成功構(gòu)建木糖代謝途徑，在葡萄糖和木糖共發(fā)酵中，釀酒酵母的木糖利用能力仍然很弱[17]。

圖3-c為尖孢鐮刀菌同步糖化發(fā)酵乙醇生成情況，釀酒酵母12 h內(nèi)迅速利用葡萄糖生成乙醇，達(dá)16 g/L左右，之后基本趨于平穩(wěn);尖孢鐮刀菌生成乙醇周期較長(zhǎng)，12～60 h內(nèi)同時(shí)利用葡萄糖和木糖，一部分用于維持菌體自身活力，另一部分用于產(chǎn)乙醇，可生產(chǎn)乙醇12 g/L左右。范金霞等以尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，設(shè)置不同比例的葡萄糖木糖混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，結(jié)果表明，葡萄糖在混合糖中被優(yōu)先利用[18]。葡萄糖的存在限制了木糖的利用，并且當(dāng)葡萄糖消耗完，尖孢鐮刀菌對(duì)木糖的利用周期較長(zhǎng)。雖然尖孢鐮刀菌用于同步糖化發(fā)酵不如傳統(tǒng)的釀酒酵母產(chǎn)量高，但其對(duì)木糖的利用以及誘導(dǎo)產(chǎn)酶都具有較大的研究意義。Paschos等使用預(yù)處理小麥秸稈為原料，由尖孢鐮刀菌生產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶液降解，釀酒酵母F12發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，減少成本的同時(shí)得到較高的乙醇產(chǎn)量[19]。

2.4 混菌培養(yǎng)同步糖化發(fā)酵

釀酒酵母作為傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株具有耐受能力強(qiáng)、不易染菌等優(yōu)點(diǎn)，但是天然的釀酒酵母不具有木糖代謝能力，而上述試驗(yàn)證明尖孢鐮刀菌能利用少量木糖，提高木糖利用率和乙醇生成率。所以，將釀酒酵母和尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。以堿處理小麥秸稈為原料，在3%葡聚糖負(fù)荷下進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，在發(fā)酵初始階段接入釀酒酵母，分別在發(fā)酵24、48、72 h后接入尖孢鐮刀菌，葡萄糖、木糖和乙醇利用情況如圖4所示。圖4-a為葡萄糖利用情況，3種情況下葡萄糖利用情況基本一致，12 h內(nèi)釀酒酵母基本上將葡萄糖全部利用完。

對(duì)于木糖利用情況如圖4-b所示，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，木糖基本不被利用，所以0～24 h繼續(xù)酶解，木糖繼續(xù)生成;當(dāng)葡萄糖消耗完全，接入尖孢鐮刀菌，木糖開始逐漸被利用，3個(gè)時(shí)間段分別接入尖孢鐮刀菌，木糖都會(huì)開始被利用，其中，24、48 h時(shí)接入木糖利用率稍高于72 h接入，可能是由于發(fā)酵后期發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分越來(lái)越少，菌種活性降低。尖孢鐮刀菌的接入為起止時(shí)間，48 h后基本上不利用木糖。其中，48 h 添加尖孢鐮刀菌試驗(yàn)組木糖利用率最高，3組試驗(yàn)中仍有8 g/L木糖未被利用。

圖4-c為乙醇生成情況，前24 h 3組試驗(yàn)乙醇生成趨勢(shì)基本一致，基本達(dá)到15 g/L左右;24～96 h，48 h加入尖孢鐮刀菌試驗(yàn)組乙醇繼續(xù)生成，96 h達(dá)到19.11 g/L，其他2組乙醇生成量最終達(dá)到17 g/L左右。2種菌混合發(fā)酵乙醇濃度19.11 g/L高于僅用釀酒酵母進(jìn)行同步糖化發(fā)酵13.75 g/L。2種菌分不同時(shí)間段添加避免了菌種之間的拮抗作用[20]，但是由于同步糖化發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一些抑制物如糠醛、甘油等，這些物質(zhì)會(huì)影響尖孢鐮刀菌對(duì)木糖的利用，所以，木糖的利用仍是木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵的一個(gè)難題。

3 結(jié)論

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，碳源、培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種的產(chǎn)酶能力影響特別大。本研究對(duì)尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶底物、培養(yǎng)基以及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分析，確定了水稻秸稈為最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶底物，最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨3 g/L，pH值6.0。在發(fā)酵后4 d羧甲基纖維素酶活性12.40 U/mL，木聚糖酶活性達(dá)到930.92 U/mL。尖孢鐮刀菌同樣用于木質(zhì)纖維素的同步糖化發(fā)酵產(chǎn)纖維素乙醇，可以同時(shí)利用葡萄糖和木糖， 木糖利用率達(dá)到49.53%，96 h生成乙

醇12.23 g/L。

尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)所產(chǎn)纖維素酶具有較好的pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性，在一定程度上能彌補(bǔ)真菌纖維素酶耐堿性差和細(xì)菌纖維素酶活性低的不足。在纖維乙醇研究中，2種菌分不同時(shí)間段添加，避免了菌種之間的拮抗作用，相比于單一菌種發(fā)酵，木糖利用率提高，乙醇濃度由13.75 g/L提高到19.11 g/L。尖孢鐮刀菌雖利用木糖產(chǎn)乙醇周期較長(zhǎng)，但是對(duì)于利用纖維素類物質(zhì)和木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇這一難點(diǎn)的解決以及利用基因工程技術(shù)培育新的菌株具有重要的研究意義。

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