黃碧青，李 菁

作者單位:100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一種病因未明的慢性、系統(tǒng)性、炎癥性疾病，主要累及滑膜關(guān)節(jié)，是最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，人群患病率約為0.5%～1%[1]。不僅遺傳和環(huán)境因素，吸煙、感染、低收入和低學(xué)歷等也是RA 的危險(xiǎn)因素[1]。近年有研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與了RA 的發(fā)病機(jī)制，在維持關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用；同時(shí)也為RA 的治療提供了潛在的新治療途徑[2]。本文就外泌體在RA 發(fā)病機(jī)制和治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的定義和功能

細(xì)胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs) 是由細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)、不能自我復(fù)制的囊泡，可以通過其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)特性，參與細(xì)胞的生理學(xué)和病理生理學(xué)過程[3]。外泌體是EVs一個(gè)重要的亞群，通常認(rèn)為外泌體是由多泡體與細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外的、直徑為40～100 nm的膜性囊泡狀小體[3]。外泌體攜帶的特定物質(zhì)與患者的疾病狀態(tài)可能有關(guān)，因此外泌體有望作為疾病的診斷標(biāo)志物。另外，由于外泌體是磷脂雙分子層囊泡，內(nèi)含物相對(duì)穩(wěn)定，是一種良好的給藥載體[3]。

2 外泌體的純化和鑒定

外泌體存在于多種體液中，包括血漿、尿液、乳汁、腦脊液、關(guān)節(jié)滑膜液等，從這些樣品中分離純化外泌體，對(duì)后續(xù)外泌體的鑒定和功能的檢測(cè)具有重要意義。目前外泌體的分離方法包括差異超速離心法、密度梯度離心法、沉淀法、超濾法、親和層析法、微流控技術(shù)等，根據(jù)特異性和回收率可以分為四大類(表1)[4]。囊泡國際協(xié)會(huì)2018 指南提出，目前最常用的外泌體分離手段依然是差異超速離心法。外泌體的鑒定需要觀察單個(gè)囊泡結(jié)構(gòu)和檢測(cè)直徑，方法包括可視化電鏡、原子力顯微鏡、超高分辨率顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、高分辨流式細(xì)胞儀等[4]。

表1 外泌體分離方法比較Table 1 Comparison of isolation methods of exosomes

3 外泌體在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用

3.1 外泌體的數(shù)量對(duì)RA 的影響

滑膜組織中淋巴細(xì)胞增生和凋亡失衡與RA 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5]。APO2 配體/腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體[APO2 ligand (APO2L) /tumor necrosis related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) ]是腫瘤壞死因子超家族中的一員，以非依賴Fas/FasL 的 方 式 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 凋 亡[6]。Martinez-Lorenzo等[7]發(fā)現(xiàn)RA 患者滑膜液中外泌體表面攜帶的FasL 和APO2L/TRAIL 數(shù)量跟創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎患者相比沒有明顯差異，但外泌體數(shù)量顯著減少，因此無法誘導(dǎo)足夠的T 細(xì)胞凋亡，從而維持RA 的炎癥狀態(tài)。

3.2 與外泌體相關(guān)的miRNA 在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用

microRNA (miRNA) 是一種含有22 個(gè)左右核苷酸的單鏈非編碼RNA，可通過結(jié)合mRNA 3' 端非編碼區(qū)抑制靶基因表達(dá)[8]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-16、miR-124a、miR-132、miR-223、miR-346、miR-363、miR-498 等與RA 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[9]。近期有研究發(fā)現(xiàn)外泌體相關(guān)的miR-155[10-12]、miR-146[10，13]、miR-17[14]等在調(diào)節(jié)炎癥過程中發(fā)揮重要作用，可能也參與RA 的發(fā)病機(jī)制(表2)。

表2 外泌體相關(guān)miRNA 在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用Table 2 Role of exosome-related miRNA in the pathogenesis of RA

RA 患者在未發(fā)病前血清中抗瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA) 就已經(jīng)存在了，這提示B 細(xì)胞可能是RA 發(fā)病的核心機(jī)制[15]。與健康人相比，ACPA＋的RA 患者外周血中IgD-CD27-的記憶B 細(xì)胞表達(dá)的miR-155 顯著升高，miR-155 通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子PU.1 促進(jìn)B 細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR) 交聯(lián)促進(jìn)抗體的產(chǎn)生[11]?；そM織中單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)也與RA 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，通過趨化因子招募血液中的單核細(xì)胞到滑膜組織是RA 疾病進(jìn)展的重要過程[16]。miR-155 還可以通過促進(jìn)單核細(xì)胞分泌趨化因子來招募T 細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入滑膜組織，并抑制滑膜組織單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表達(dá)CCR2，使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜組織，參與RA 的發(fā)病機(jī)制[12]。外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的miR-155 的拷貝數(shù)與DAS28、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)目、血沉相關(guān)，miR-155有望作為RA 活動(dòng)性的標(biāo)志物[12]。

RA 患者外周血和滑膜液中CD4＋T 細(xì)胞高表達(dá)miR-146，過表達(dá)的miR-146 通過結(jié)合Fas 相關(guān)因子1 基因抑制T 細(xì)胞凋亡參與RA 的發(fā)病機(jī)制，而且體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以促進(jìn)T 細(xì)胞表達(dá)miR-146，miR-146 有望作為抗TNF 治療RA 的療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)[13]。

Treg 細(xì)胞數(shù)量減少和功能缺陷也與RA 發(fā)病有關(guān)[17]。RA 患者血漿來源的外泌體攜帶的miR-17可以通過結(jié)合TGFβRⅡ抑制Treg 細(xì)胞分化參與RA的發(fā)病機(jī)制[14]。

3.3 外泌體攜帶的蛋白質(zhì)在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用

外泌體可以攜帶多種蛋白質(zhì)，目前有文獻(xiàn)報(bào)道外泌體攜帶的蛋白質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)炎癥參與RA 的發(fā)病機(jī)制[18-22](表3)。

表3 外泌體攜帶的蛋白質(zhì)在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用Table 3 Role of protein carried by exosomes in the pathogenesis of RA

蛋白瓜氨酸化可產(chǎn)生新的表位被免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生ACPA，參與RA 的發(fā)病過程[1]。RA 患者滑膜液中外泌體表面攜帶的纖連蛋白通過整合素與IgG 和瓜氨酸蛋白結(jié)合為復(fù)合物，這可能可以解釋為何大于60%的RA 患者同時(shí)有類風(fēng)濕因子和ACPA[18]。纖連蛋白可以在沒有樹突細(xì)胞的輔助下直接刺激T 細(xì)胞活化，而瓜氨酸蛋白與其抗體形成的免疫復(fù)合物可能加強(qiáng)T 細(xì)胞活化[18]，從而參與RA 的發(fā)病機(jī)制。

DNA 結(jié)合抑制因子1 (Inhibitor of DNA binding 1，Id1) 是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，是細(xì)胞自我更新的標(biāo)志[23]。RA 患者滑膜液和滑膜成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中含有大量的Id1，Id1可通過活化Jnk 信號(hào)通路促進(jìn)血管生成[19]；還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、抑制IL-6 和IL-8 的分泌參與RA 的發(fā)病機(jī)制[20]。

TNF-α 可以活化AKT 和NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶1 破壞細(xì)胞外基質(zhì)，并阻斷活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡途徑從而抑制T細(xì)胞凋亡[21]。Zhang 等[22]發(fā)現(xiàn)RA 患者滑膜成纖維細(xì)胞分泌的外泌體表面有膜結(jié)合性TNF-α，用可溶性TNFR1 結(jié)合外泌體表面TNF-α 時(shí)，可部分阻斷這種效應(yīng)，說明外泌體攜帶的其他成分可能也參與了RA 發(fā)病的這一過程。

4 外泌體在RA 中的應(yīng)用前景

由于外泌體是雙層脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)含物相對(duì)穩(wěn)定[3]；并且不同生理和病理?xiàng)l件下、不同細(xì)胞分泌的外泌體，其攜帶的內(nèi)容物不一樣[3]。因此，外泌體攜帶的特定物質(zhì)與患者的疾病狀態(tài)可能有關(guān)，外泌體有望作為疾病的診斷標(biāo)志物[3]。此外，目前已有利用不同來源的外泌體治療RA 動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)道[24-28](表4)。

表4 外泌體治療RA 動(dòng)物模型的可能機(jī)制Table 4 Possible mechanism of exosomes in the treatment of RA animal model

4.1 外泌體具有作為RA 標(biāo)志物的潛在價(jià)值

Hotair 是一種2.2kb[29]的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。Song 等[30]通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)RA 患者血清外泌體中的Hotair 與健康人和C-反應(yīng)蛋白高的非RA 患者相比顯著升高，而且與RA 活動(dòng)程度相關(guān)，通過檢測(cè)外泌體攜帶的Hotair 可反映RA 患者的疾病狀態(tài)，因此Hotair 有望成為RA 病情活動(dòng)的特異性標(biāo)志物。

4.2 外泌體在CIA 動(dòng)物模型中的應(yīng)用

不同來源的外泌體具有不同的功能[3]。Cosenza 等[24]發(fā)現(xiàn)利用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體治療CIA 小鼠可以有效減輕關(guān)節(jié)炎癥，MSCs 分泌的外泌體是通過減少CD4＋T 細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞、CD4＋I(xiàn)L-10＋Treg1 細(xì)胞和漿母細(xì)胞數(shù)量，增加CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞、CD19＋I(xiàn)L-10＋Breg-like 細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮抗炎作用[24]；若反復(fù)凍融外泌體會(huì)導(dǎo)致外泌體聚集、膜破裂或數(shù)量減少，影響其抗炎效應(yīng)[24]。

Kim 等分別用IL-10[26]、IL-4[25]、FasL[27]、吲哚胺2，3-雙加氧酶1 (IDO1)[28]轉(zhuǎn)染骨髓來源的樹突狀細(xì)胞 (bone marrow derived dendritic cell，BM-DC) 及其分泌的外泌體 (Exo/IL-10、Exo/IL-4、Exo/FasL、Exo/IDO1) 治療CIA 小鼠。研究發(fā)現(xiàn)無論是關(guān)節(jié)局部注射還是全身給予Exo/IL-10治療CIA 小鼠，關(guān)節(jié)炎癥都可以緩解[26]。該機(jī)制可能是通過抑制T 細(xì)胞增生，減少滑膜組織表達(dá)Hsp70，Hsp70 可使體內(nèi)耐受型T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為自身反應(yīng)型T 細(xì)胞，從而發(fā)揮抗RA 治療作用[26]。IL-4轉(zhuǎn)染的BM-DC 和Exo/IL-4 是通過依賴MHC-Ⅱ和FasL/Fas 機(jī)制調(diào)節(jié)體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞和T 細(xì)胞活性，從而在CIA 小鼠治療中發(fā)揮作用[25]。另外，Exo/FasL 治療CIA 小鼠也是通過依賴MHC-Ⅱ途徑減少抗原特異性T 細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮抗炎作用[27]。Exo/IDO1 是以依賴B7 共刺激分子的形式通過消耗色氨酸和或產(chǎn)生有毒代謝物抑制T 細(xì)胞，并促進(jìn)Treg 細(xì)胞的分化發(fā)揮免疫抑制作用[28]。雖然利用IL-10、IL-4、FasL、IDO1 處理過的BM-DC 治療RA 效果與Exo/IL-10、Exo/IL-4、Exo/FasL、Exo/IDO1 相似[25-28]，但直接注射BM-DC 治療RA，BM-DC 在體內(nèi)代謝過程中可能會(huì)發(fā)生表型改變。而外泌體由于不含細(xì)胞核、無法自我復(fù)制、具有高穩(wěn)定性；脂溶性高，可以跨越生物屏障，不會(huì)引起免疫排斥，治療RA 可能更安全，更有效[3]。

5 小結(jié)

由于RA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，雖然目前有研究發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的miRNA、蛋白質(zhì)參與了RA 的發(fā)病機(jī)制，并且利用外泌體治療RA 在動(dòng)物模型上取得了一定的進(jìn)展，但是目前還缺乏高特異性、高回收率的外泌體分離方法，需要開發(fā)新的技術(shù)以提高外泌體的純化率和回收率。所以將其應(yīng)用于RA 患者身上，還需要進(jìn)一步研究外泌體的各種成分在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用，以及這些成分之間的相互作用對(duì)RA 的影響，再開展臨床研究。