肖婧薇，王文佳，何華紅，李 薇

（廣東省廣州市藥品檢驗所醫(yī)療器械及藥包材<藥理>室，廣東 廣州 510610）

大豆磷脂酰膽堿是大豆磷脂的主要活性成分，大豆磷脂作為天然乳化劑、增溶劑、分散劑廣泛應(yīng)用于藥物注射劑中[1-2]，故大豆磷脂酰膽堿也是一種用于注射劑的藥用輔料。注射劑直接注入人體，其細(xì)菌內(nèi)毒素的含量或限值有嚴(yán)格規(guī)定，所用輔料也必須符合相應(yīng)規(guī)定。2015年版《中國藥典》尚未將大豆磷脂酰膽堿作為藥用輔料收載，本研究中參照2015年版《中國藥典（四部）》通則1143[3]154-157“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，全面考察了大豆磷脂酰膽堿的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，以進(jìn)一步控制注射劑質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：TW12型六孔恒溫水?。ǖ聡鳭ulabo公司）；MS3basic型旋渦混合器（德國IKA公司）；LKL164-03型內(nèi)毒素定量儀（英國Lab Kinetics公司）；2-16KL型低溫高速離心機(jī)（德國Sigma公司）。

試藥：大豆磷脂酰膽堿（德國Lipoid GmbH，批號為579010-1150055-13，579010-1160058-15，579010-1160059-05，規(guī)格為原料，含量為98%）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-201580，規(guī)格為每支80 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號為1606290，規(guī)格為每支100 mL），鱟試劑 A（TAL，批號分別為 1606142，1607201，規(guī)格為每支0.1mL，靈敏度分別為0.25EU/mL和0.06EU/mL），鱟試劑 C（KCA，批號為1709140，規(guī)格為每支1.25 mL，靈敏度為50～0.005 EU/mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；鱟試劑B（TAL，福州新北生物有限公司，規(guī)格為每支 0.1 mL，批號分別為 16031712，16020712，靈敏度分別為0.25 EU/mL和0.06 EU/mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值

各國藥典均未收載該品種，而在廠家所附標(biāo)準(zhǔn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素限值為每1 g大豆磷脂酰膽堿含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于6 EU。該品種是大豆磷脂的主要活性成分，其在藥物制劑中的功能和用途與大豆磷脂相似，2015年版《中國藥典（四部）》收載的大豆磷脂（供注射用）[3]468-470的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為每1 g大豆磷脂含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2.0 EU。綜合考慮，本研究限值確定為2.0 EU/g。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測（凝膠法）

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行鱟試劑標(biāo)示靈敏度（λ）復(fù)核。結(jié)果4批鱟試劑λc為0.5～2.0 λ，符合進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定。詳見表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果(凝膠法)

2.2.2 干擾預(yù)試驗

最小質(zhì)量濃度計算：最小有效稀釋濃度C=λ/L，L=2.0 EU/g。目前用于藥品檢驗的市售鱟試劑靈敏度一般為0.25～0.03 EU/mL，因此相對應(yīng)的最小有效質(zhì)量濃度為 125.00，62.50，31.25，15.62 g/L。

溶液制備：取3批樣品，用BET用水溶解制成質(zhì)量濃度為125 g/L的供試品溶液，置旋渦振蕩器振蕩5 min使充分混勻，再稀釋成3個質(zhì)量濃度梯度的系列溶液，標(biāo)記為供試品管（NPC系列）；取NPC系列溶液，加入細(xì)菌內(nèi)毒素，制得每個稀釋度中含2 λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液，標(biāo)記為供試品陽性對照管（PPC系列）。

操作步驟：取靈敏度為0.25 EU/mL的2個不同廠家的TAL，每個質(zhì)量濃度的NPC和PPC各做2管，同時做細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對照（PC）和BET用水陰性對照（NC）各2管。結(jié)果3批樣品質(zhì)量濃度在62.5 g/L及以下時對2個廠家鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無干擾作用。詳見表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果(凝膠法)

2.2.3 正式干擾試驗

取3批樣品適量，分別用BET用水制成質(zhì)量濃度為 62.5 g/L 的溶液，并制成含 2 λ，1 λ，0.5 λ，0.25 λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液，取靈敏度為0.25 EU/mL的2個廠家的鱟試劑，按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143中的“干擾試驗”項下方法試驗。以BET用水進(jìn)行對照。結(jié)果內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es）和供試品溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5 λ～2.0 λ范圍內(nèi)，3批樣品質(zhì)量濃度為62.5 g/L時對2個廠家鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無增強(qiáng)或抑制的干擾作用。故大豆磷脂酰膽堿（94%）的最大不干擾質(zhì)量濃度為62.5 g/L。詳見表3。

表3 樣品干擾試驗結(jié)果(凝膠法)

2.2.4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143中的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，用靈敏度為0.06 EU/mL的鱟試劑分別對3批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。詳見表4。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果(凝膠法)

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測（顯色基質(zhì)法）

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗

取1支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL BET用水溶解，再稀釋成濃度分別為 10，1，0.1，0.01 EU/mL的系列溶液，各取0.1 mL，分別與0.1 mL鱟試劑混勻，每個濃度平行做3支管，置內(nèi)毒素定量儀中，在（37±1）℃下進(jìn)行檢測。以BET用水作陰性對照。結(jié)果回歸方程為lgTg=2.881 3-0.308 0 lgC（r=-0.999 6），陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點的反應(yīng)時間，各反應(yīng)點平行管之間的變異系數(shù)（CV）均小于10%，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，試驗方法成立。詳見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗結(jié)果(顯色基質(zhì)法)

2.3.2 干擾試驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點的濃度為0.01 EU/mL，故最小有效稀釋質(zhì)量濃度為5 g/L。取3批樣品適量，用BET用水溶解成質(zhì)量濃度為125 g/L的溶液，置旋渦振蕩器振蕩5 min，稀釋成質(zhì)量濃度為 62.5，31.25，15.6 g/L的系列梯度溶液，作為供試品溶液（A液）；另外，制成含0.5 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液（B液），充分振蕩，215×1g離心 5 min，立即取上清液，分別取0.1 mL與0.1 mL鱟試劑混勻，每個質(zhì)量濃度平行做2支管，于內(nèi)毒素定量儀中進(jìn)行檢測。結(jié)果3批樣品質(zhì)量濃度在62.5 g/L及以下時，細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率在50%～200%之間，表明樣品對動態(tài)顯色法下鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾作用。詳見表6。

表6 樣品干擾試驗結(jié)果(顯色基質(zhì)法，n=2)

2.3.3 內(nèi)毒素回收試驗

3批樣品各稱取4份，分別用含細(xì)菌內(nèi)毒素0，0.1，0.2，0.4 EU/mL的BET用水溶解成質(zhì)量濃度為110 g/L的溶液（每1 g大豆磷脂酰膽堿對應(yīng)的內(nèi)毒素含量為0，0.9，1.8，3.6 EU），充分振蕩 5 min，用 BET 用水稀釋1倍，振蕩均勻，215×1g離心5 min，立即取上清液進(jìn)行檢測。結(jié)果3批大豆磷脂酰膽堿均未檢出細(xì)菌內(nèi)毒素，內(nèi)毒素加入量為0.05，0.10，0.20 EU/mL時的回收率均為75% ～112%，表明供試品溶液制備過程中的離心處理不會影響細(xì)菌內(nèi)毒素的檢出。詳見表7。

3 討論

近年來，由于藥用輔料的問題導(dǎo)致的藥品嚴(yán)重不良反應(yīng)或影響用藥安全的事件層出不窮[4-6]，究其原因主要為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善、使用方法不規(guī)范[7]。2015年版《中國藥典》中藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)收載量僅270種，其中供注射用藥用輔料23種，與美國藥典、歐洲藥典中1 000多種的收載量比相差較大，因此，藥用輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善迫在眉睫。大豆磷脂酰膽堿作為藥用輔料的新品種，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和制訂更應(yīng)受到重視。對注射劑常用藥用輔料應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性檢查，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是其安全性檢查中必不可少的一項[3]400-402。

表7 回收試驗結(jié)果(顯色基質(zhì)法)

2015年版《中國藥典》收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，供試品檢測時可使用其中任意一種方法，但當(dāng)結(jié)果有爭議時凝膠法為仲裁方法[3]154-157，因此本研究中首先采用凝膠法考察大豆磷脂酰膽堿細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性。結(jié)果表明，大豆磷脂酰膽堿質(zhì)量濃度在62.5g/L及以下時對2個廠家生產(chǎn)的鱟試劑無干擾作用，但使用靈敏度為0.125～0.03 EU/mL的凝膠法鱟試劑對該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定性檢查，且限值可定為2.0 EU/g。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的光度測定法包括濁度法和顯色基質(zhì)法，結(jié)果可準(zhǔn)確反映細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，對生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制意義重大。大豆磷脂酰膽堿不能完全溶于水，在本試驗濃度下，樣品與水只能形成混懸液。混懸液的反應(yīng)體系對2.2項試驗反應(yīng)并無影響，但對2.3項試驗中吸光度的檢測有一定影響，因此將供試品溶液離心，取上清液進(jìn)行檢測。為了考察萃取處理是否會影響細(xì)菌內(nèi)毒素的檢出，在配制供試品時添加細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外加內(nèi)毒素回收試驗[3]154-157。在該情況下，一般會采取特殊方法來制備供試液，如增溶[8]、萃取[9-10]、過濾[11]等，再進(jìn)行外加內(nèi)毒素回收試驗，以考察處理方法是否會影響內(nèi)毒素的檢出。本研究中，前期曾嘗試過加入乙醇以增加溶解性，但效果不佳，也曾嘗試過微膜濾過以去除混懸液中的顆粒，但極易堵塞濾頭。最后經(jīng)試驗證實，采用振蕩混勻并離心取上清液的操作可行。但得到的供試液并非澄清透明，仍有輕度混濁，會影響濁度法中濁度的測定，而顯色基質(zhì)法是通過測定呈色團(tuán)的吸光度來反應(yīng)內(nèi)毒素的含量，因此不會影響檢測結(jié)果，可進(jìn)一步進(jìn)行干擾試驗和回收試驗。經(jīng)考察，大豆磷脂酰膽堿在質(zhì)量濃度62.5 g/L及以下時對試驗結(jié)果無干擾作用，且供試液制備過程中的萃取操作不會對供試品本底細(xì)菌內(nèi)毒素造成影響，可采用動態(tài)顯色法鱟試劑對該品種進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測。

綜上所述，凝膠法與動態(tài)顯色法均可用于大豆磷脂酰膽堿的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，本研究結(jié)果為該品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的制訂提供參考。但本試驗樣品量較少，要制訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還需更多批次的試驗數(shù)據(jù)加以驗證。