李 紅 胡志軍

陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院脾胃肝病二科(721000)

背景：烏司他丁是急性胰腺炎(AP)的重要治療藥物，然而不同患者的療效具有一定差異。目的：探討SPINK1基因多態(tài)性對烏司他丁治療AP療效的影響。方法：納入2005年1月—2015年12月寶雞市中醫(yī)醫(yī)院收治的AP患者572例，靜脈滴注烏司他丁100 000 U治療。采用PCR法檢測SPINK1基因多態(tài)性，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10以及血尿淀粉酶水平，并評估烏司他丁的療效。結(jié)果：AP患者c.101A>G位點突變率明顯高于對照組(P<0.05)。c.200G>A位點突變的SPINK1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。c.36G>C、c.200G>A位點突變的黃疸緩解率均顯著低于野生型(P<0.05)。c.200G>A位點突變的TNF-α、IL-8水平顯著低于野生型(P<0.05)。c.200G>A組患者血尿淀粉酶陽性數(shù)減少的趨勢較平緩。c.36G>C、c.200G>A位點突變的治療有效率顯著低于野生型(P<0.05)。結(jié)論：AP患者c.101A>G突變率高于普通人群，c.36G>C、c.200G>A位點突變能影響烏司他丁對AP患者的療效。

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是普外科常見的危急重癥，主要癥狀為飽餐或飲酒后突發(fā)的上腹部或左上腹部持續(xù)性劇痛，伴惡心、嘔吐、發(fā)熱以及血淀粉酶增高。AP病情兇險，進展迅速，若未得到及時有效的治療，預后較差。隨著人民生活水平的提高和飲食習慣的改變，AP的發(fā)病率逐漸呈上升趨勢[1]。因此探討AP的治療方法具有重要意義。烏司他丁是目前公認安全價廉的胰蛋白酶抑制劑[2-3]，可用于治療AP。烏司他丁能有效降低AP患者血清CRP、IL-6、TNF-α表達水平，具有潛在的抗感染作用[2]。然而,不同AP患者對烏司他丁的療效仍具有一定差異，患者個體基因多態(tài)性可能是重要的影響因素之一[4]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal type 1, SPINK1)是近年發(fā)現(xiàn)的與慢性胰腺炎和胰腺癌相關(guān)的一種酶抑制劑，其丟失與慢性胰腺炎和胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5-6]。然而，目前關(guān)于SPINK1對烏司他丁療效影響的研究較為少見。本研究通過檢測AP患者SPINK1基因多態(tài)性，旨在探討不同SPINK1突變位點對烏司他丁治療效果的影響，從而為實現(xiàn)個體化用藥提供一定的理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

納入2005年1月—2015年12月寶雞市中醫(yī)醫(yī)院就診的AP患者572例。所有患者均符合中華醫(yī)學會消化病學分會胰腺疾病學組制定的《中國急性胰腺炎診治指南(2013年,上海)》診斷標準[7]：有急性、持續(xù)性腹痛等臨床表現(xiàn)；血、尿淀粉酶顯著升高以及影像學檢查(超聲或CT)顯示胰腺形態(tài)學發(fā)生改變；病程小于1周。同時排除慢性胰腺炎急性加重者。572例AP患者中，男性432例，女性140例；平均年齡(40.2±6.7)歲；平均病程(1.6±0.2) d；APACHEⅡ評分(6.2±1.5)分；發(fā)病原因為膽囊性疾病205例，酒精性疾病238例，不明原因129例；輕度399例，重度173例。另取同期行健康體檢者549名作為對照組，其中男性427名，女性122名，平均年齡(41.0±8.6)歲。兩組性別、年齡相比無明顯差異(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)寶雞市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，入選者均取得知情同意。

二、方法

1. 治療方案：持續(xù)監(jiān)測AP患者生命體征，常規(guī)給予禁食、吸氧、鎮(zhèn)靜、補液、營養(yǎng)支持，必要時給予胃腸減壓、抗感染治療。在此基礎(chǔ)上接受注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H19990133)治療。將烏司他丁100 000 U溶于5%葡萄糖注射液250 mL中，靜脈滴注2 h，2次/d，3 d后改為1次/d，療程共5～10 d。

2. 基因突變的檢測：患者入院后抽取靜脈血 5 mL置于抗凝管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清；雙蒸水200 μL重懸，樣品中加入150 μL NaCl，室溫8 000 r/min離心20 min，去沉淀，然后在上清液中加入等體積預冷異丙醇，混勻，20 ℃處理30 min，14 000 r/min離心10 min，去上清液，加70%乙醇500 μL，13 000 r/min離心12 min；棄乙醇，沉淀干燥后，加TE緩沖液30 μL溶解DNA。應用Primer Express軟件設(shè)計突變引物序列(表1)。PCR反應體系：模板DNA 50 ng，15 μmol/L上、下游引物1 μL，0.2 mmol/L dNTP 5 μL，10×PCR緩沖液5 μL，1 U Taq酶1 μL (Promega公司)，補充ddH2O至體積為50 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。上美國ABI公司9700型 PCR儀。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下DNA條帶，使用膠回收試劑盒(Qiagen公司)進行溶膠、過柱、洗滌、洗脫，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序。

3. mRNA表達的檢測：TRIzol法提取血液RNA，采用RT-qPCR法檢測SPINK1 mRNA表達[8]，具體步驟按試劑盒說明書操作。

表1 突變引物序列

4. ELISA法：分別于入院后第0、5、7、10天抽取患者抗凝血5 mL，10 000 r/min離心3 min，取上清，采用ELISA法(試劑盒購自晶美生物工程有限公司)檢測血清TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10以及血淀粉酶水平，留取尿液檢測尿淀粉酶水平。血淀粉酶>300 U/L定義為陽性，尿淀粉酶>1 000 U/L定義為陽性。

5. 療效評價：按顯效、有效和無效來進行療效評定。顯效：1周內(nèi)發(fā)熱、腹痛、嘔吐、惡心、黃疸等癥狀和體征消失，3/4以上的指標降至正常范圍；有效：1周內(nèi)發(fā)熱、腹痛、嘔吐、惡心、黃疸等癥狀和體征有所好轉(zhuǎn)，1/2以上的指標降至正常范圍；無效：1周內(nèi)發(fā)熱、腹痛、嘔吐、惡心、黃疸等癥狀和體征無明顯緩解或加重，血尿淀粉酶無下降或出現(xiàn)并發(fā)癥?？傆行?%)=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、SPINK1基因突變情況

AP組、對照組均可見SPINK1基因c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C與c.200G>A位點突變，其中AP患者c.101A>G位點的突變率明顯高于對照組(3.1%對1.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者SPINK1基因多態(tài)性 (n)

*與對照組比較，P<0.05

二、不同突變對mRNA表達的影響

PCR結(jié)果顯示,具有SPINK1基因c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C和c.200G>A突變位點的患者SPINK1 mRNA表達呈下降趨勢，其中c.200G>A突變患者SPINK1 mRNA表達顯著低于c.101A>G突變患者(0.84±0.09對1.03±0.06，P<0.05)(圖1)。

三、療效評估

1. 臨床癥狀：SPINK1基因發(fā)生c.36G>C、c.200G>A位點突變時，AP患者黃疸緩解率均顯著低于野生型(83.3%、75.0%對98.3%，P<0.05)，而其余突變位點的腹痛、嘔吐、黃疸緩解情況與野生型無明顯差異(圖2)。

2. 炎癥因子：與野生型相比，c.200G>A位點突變者的TNF-α、IL-8水平顯著降低(P<0.05)，而其余突變位點的炎癥因子水平無明顯差異(圖3)。

*與c.101A>G突變患者比較，P<0.05

*與野生型比較，P<0.05

*與野生型比較，P<0.05

3. 胰淀粉酶：突變型、野生型患者的血淀粉酶、尿淀粉酶陽性率相比無明顯差異(P>0.05)(圖4)。對突變型行亞組分析發(fā)現(xiàn)，c.200G>A位點突變患者血尿淀粉酶陽性例數(shù)減少的趨勢較為平緩(圖5)。

4. 療效觀察：與野生型相比，c.36G>C、c.200G>A位點突變的AP患者的治療有效率明顯降低(P<0.05)，其余兩個突變位點無明顯差異(P>0.05)(表3)。

討 論

AP是由于胰腺外分泌突然增加，胰管內(nèi)壓力增高，胰泡破裂，致使含有大量胰酶的胰液外滲引起的急性自身消化性炎癥。SPINK1是一種酶抑制劑，在慢性胰腺炎和胰腺癌中的表達顯著低于正常對照組[5]。有研究指出，SPINK1基因突變與無胰腺炎家族史的慢性胰腺炎相關(guān)[6]。SPINK1基因N34S突變在特發(fā)性慢性胰腺炎中的發(fā)生率較高，提示該基因突變可能是特發(fā)性慢性胰腺炎發(fā)病的危險因素之一[9-10]。本研究結(jié)果顯示，AP患者和對照組的SPINK1基因均可見c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C、c.200G>A位點突變，其中AP患者c.101A>G位點突變率明顯高于對照組。

A：血淀粉酶；B：尿淀粉酶

A：血淀粉酶；B：尿淀粉酶

組別例數(shù)顯效有效無效突變型3615174 c.101A>G18891 c.163C>T8440 c .36G>C6222? c. 200G>A4121?野生型53624127718

*與野生型相比，P<0.05

烏司他丁是一種由143個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為67 kDa(1 Da=0.992 1 u)的酸性糖蛋白，其價格低廉，癥狀緩解快，不良反應小，目前廣泛用于AP的治療。多中心隨機對照試驗顯示烏司他丁用于治療急性水腫型胰腺炎和出血壞死型胰腺炎均有較好的療效，不良反應較少[11]。王珊等[12]在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予重度AP患者烏司他丁每天3次靜脈滴注，可改善患者炎癥反應，提高臨床療效。本研究結(jié)果顯示，AP患者SPINK1基因發(fā)生c.36G>C、c.200G>A位點突變時，黃疸緩解率均明顯低于野生型；c.200G>A位點突變的TNF-α、IL-8水平明顯低于野生型；c.200G>A突變位點的血尿淀粉酶陽性例數(shù)減少的趨勢最為平緩；c.36G>C、c.200G>A突變位點的總有效率顯著低于野生型。說明c.36G>C、c.200G>A位點突變會降低烏司他丁對AP的療效。c.36G>C突變區(qū)域為外顯子1，而c.200G>A突變區(qū)域位于外顯子4，兩者均能影響氨基酸的改變，且c.200G>A突變已被證實為致病基因。本研究結(jié)果還顯示發(fā)生c.200G>A突變時，SPINK1 mRNA表達水平下降，可能為其影響烏司他丁對AP患者療效的機制[13-16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AP患者SPINK1基因c.101A>G位點突變情況高于普通人群，c.36G>C、c.200G>A位點突變能影響烏司他丁對AP患者的療效，對于后續(xù)判斷患者的預后具有一定的臨床借鑒意義。但研究結(jié)論尚需行多中心、大規(guī)模前瞻性臨床試驗進一步證實。