王 睿 程 平

(1.四川大學生物治療國家重點實驗室,四川成都 610041;2.中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠,四川成都 610100)

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）由Ellis等（1998）首次從斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）病豬體內分離到，屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，已證明是PMWS發(fā)生的必要病原。目前，我國豬圓環(huán)病毒2型市售疫苗主要以滅活全病毒疫苗為主，表達蛋白疫苗也在逐漸增多。在對其疫苗效力進行評價時，常采用免疫動物，采集血清，通過測定血清抗體效價的方法進行。目前，市場上有很多檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，不同廠家的試劑盒其成分均有差別，對同一樣本的評價也是高低不一。因此，使用市售Elisa試劑盒對不同廠家疫苗進行評價，很難有一個清楚的結果。因此，我們嘗試建立一種適合于經(jīng)滅活疫苗免疫的豬血清抗體檢測的間接Elisa，為我廠疫苗產(chǎn)品的改進優(yōu)化提供較為可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白由中牧研究院表達制備；酶標板，購自Thermo公司；牛血清白蛋白（BSA），購自Amresco公司；酪蛋白，購自Sigma公司；HRP標記羊抗豬酶標二抗購自KPL公司；可溶型單組分TMP底物溶液、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購自TIANGEN公司。

1.2 豬圓環(huán)病毒2型抗體陽性對照血清和陰性對照血清制備

豬圓環(huán)病毒2型抗體陽性對照血清，采用豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，以1頭份/頭的劑量免疫2月齡無豬圓環(huán)病毒2型抗體的仔豬，21d后以2頭份/頭的劑量重復免疫，14d后頸動脈采血，無菌分離血清。陰性對照血清為2月齡無豬圓環(huán)病毒2型抗體仔豬，前腔靜脈采血，分離血清。

1.3 封閉溶液的選擇

1.3.1 空白封閉實驗

將BSA、脫脂奶粉、雞血清、羊血清、兔血清、酪蛋白，用0.01M PBS配置為濃度為5%的封閉液，每種加兩孔，每孔300μl。同時設一列無封閉對照組，每孔加入300μ0.01M PBS，37℃封閉2h。用PBST洗板1次，將1：50倍稀釋的陽性血清及陰性血清加入反應板，每孔加入100μl，37℃反應1h。用PBST洗滌3次，每孔加入100μl工作濃度的HRP標記羊抗豬二抗，37℃反應1h。用PBST洗滌3次，每孔加入TMB顯色液100μL，避光顯色15min，每孔加入100μl終止液，于450nm處讀取OD值。

1.3.2 Western Blot定性檢測實驗

將BSA、脫脂奶粉、雞血清、羊血清、兔血清、酪蛋白溶液，經(jīng)12% SDS PAGE電泳，100v電轉移至孔徑為0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入經(jīng)稀釋的豬圓環(huán)病毒2型抗體陽性對照血清，4℃過夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入工作濃度的HRP標記羊抗豬酶標二抗，室溫作用1h，經(jīng)TBST漂洗3次，用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色5min，用純化水沖洗終止顯色，拍照。

1.4 抗原最佳包被濃度的確定

采用棋盤滴定法。將Cap蛋白在酶標板上從左到右按照10、5、4、3、2、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/ml濃度稀釋，最后一列作為空白對照，每孔100μl，4℃放置過夜。用PBST洗板1次，每孔加入5%酪蛋白，37℃封閉2h。將陽性血清和陰性血清做1：50稀釋，每個包被濃度加6孔經(jīng)稀釋的陽性血清和2孔經(jīng)稀釋的陰性血清，每孔100μl，37℃作用1h，用PBST洗板3次，每孔加入經(jīng)說明書推薦稀釋的HRP標記羊抗豬酶標二抗，37℃作用1h，用PBST洗板3次，每孔加入可溶型單組分TMP底物溶液100μl，避光顯色15min，每孔加入100μl終止液，于450nm處讀取OD值。分別計算各包被濃度的陽性平均值P和陰性平均值N，以包被濃度為橫坐標，分別以P-N和P/N為縱坐標做圖，選擇P-N平臺期內P/N最大的點為最佳包被濃度。

1.5 最佳封閉液濃度的確定

將Cap蛋白按0.3μg/ml包被后，將封閉液酪蛋白按5%、4%、3%、2%、1%、0%濃度封閉，將陽性血清按1：50稀釋后進行Elisa檢測，分別計算各封閉濃度的陽性平均值Pn，以封閉液濃度為橫坐標、以Pn/P0為縱坐標做圖，選擇Pn/P0最小的最低酪蛋白濃度為最佳封閉液濃度。

1.6 酶標二抗最適工作濃度的確定

在酶標二抗推薦使用濃度的范圍內，對酶標二抗?jié)舛冗M行進一步摸索，尋找一個適用于本方法的最佳稀釋度。將酶標二抗進行500倍、1000倍、2000倍、4000倍稀釋，選取P/N值最高的作為最適工作濃度。

1.7 豬圓環(huán)病毒2型抗體間接Elisa檢測方法臨界值的確定

田間采集經(jīng)豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫豬血清177份和115份未免疫的豬圓環(huán)病毒2型抗體陰性豬血清。用建立的豬圓環(huán)病毒2型抗體間接Elisa檢測方法進行檢測。利用SPSS軟件對所有血清的OD值進行數(shù)據(jù)分析[1-4]。以敏感性為縱坐標，1-特異性為橫坐標，繪制ROC曲線，曲線每個點代表每個臨界值對應的敏感性和特異性。計算每個臨界值的Youden指數(shù)，選擇Youden指數(shù)最大的OD值為臨界值。

1.8 特異性實驗

采集PRV、PPV、PRRSV、CSFV陽性豬血清，經(jīng)病毒中和試驗檢驗豬圓環(huán)病毒2型抗體為陰性后，用建立的間接Elisa方法對上述血清進行檢驗，判斷是否具有交叉反應。

1.9 Elisa檢測結果可比性驗證

將陽性血清用陰性血清自1：25開始，做2倍梯度稀釋，得到12個不同的陽性血清：SC1、SC2、SC3、SC4、SC5、SC6、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC12，將這些陽性血清用血清稀釋液做2倍梯度稀釋，做8個稀釋度，用建立的豬圓環(huán)病毒2型抗體間接Elisa檢測方法進行檢測。將檢測結果以1/稀釋度為橫坐標，以OD值為縱坐標作圖，以驗證該方法是否適用于比較經(jīng)免疫后的血清抗體水平。

2 結果

（1）空白封閉結果（表1）顯示，BSA、脫脂奶粉、羊血清、兔血清均會和經(jīng)疫苗免疫制備的陽性血清發(fā)生反應，雞血清和酪蛋白與陽性血清無明顯反應；經(jīng)Western Blot驗證（圖1），在膜未封閉的情況下，背景為黑色，BSA、羊血清、兔血清均存在與免疫血清反應的情況，為淺灰色條帶，脫脂奶粉、雞血清有部分灰色條帶和部分明亮白色條帶，酪蛋白基本不與血清無反應，為明亮的白色條帶；結合兩個結果，雞血清和酪蛋白對Elisa結果干擾均較小，綜合考察選擇酪蛋白溶液作為封閉液。

表1

圖1

（2）根據(jù)抗原包被濃度變化，P-N（圖2）在10μg至0.3μg基本沒有變化，而P/N（圖3）在逐漸升高，綜合考慮，抗原最佳包被濃度為0.3μg/ml。

圖2

圖3

（3）根據(jù)不同濃度封閉液的Pn/P0（圖4），最適酪蛋白封閉液濃度為3%。

圖4

（4）根據(jù)不同濃度酶標二抗P/N值，最適稀釋度為1：1000

圖5

（5）通過檢測陰陽性血清，得到的OD450值經(jīng)SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算敏感度和特異性（圖6），得到Youden指數(shù)最大值為0.994，對應臨界值為0.2985，選擇近似值0.300為臨界值。

圖6

（6）通過對PRV、PPV、PRRSV、CSFV陽性豬血清檢測，所有陽性血清均為陰性反應，說明建立的Elisa檢測與上述豬常見疾病無交叉反應。

（7）以1/稀釋度為橫坐標，以OD值為縱坐標作圖（圖7），顯示，該Elisa方法適合用于比較血清抗體水平。

圖7

3 討論

關于間接Elisa方法檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的的報道極多，但少有針對經(jīng)疫苗免疫血清抗體水平檢測的，本方法的建立是有意義的。但如何將檢測結果轉化為可量化的數(shù)據(jù)，還需要建立更為適合的數(shù)據(jù)處理方法。