高效液相色譜-示差折光測定蜂蜜中5種還原糖的含量

馬蓉 徐昊 李紅梅 周露 徐虹 范明紅

摘? 要：目的：建立一種蜂蜜中5種還原糖含量的測定方法。方法：色譜柱采用上海安譜公司的CNW Athena NH2柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈（A有機(jī)相）和水（B無機(jī)相）的比例為82∶18為流動(dòng)相，采用Waters 2414示差折光檢測器外標(biāo)法測定蜂蜜中5種還原糖的含量。結(jié)果：蜂蜜中5種還原糖的線性范圍在2.5～40mg /mL，該方法的最小檢出限為5mg/L，加標(biāo)回收率在90.95%～100.02%，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.43%～5.44%。結(jié)論：該方法精密度好、回收率和準(zhǔn)確度較高，適用于蜂蜜中5種還原糖含量的定量分析。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;果糖;麥芽糖;葡萄糖;蔗糖;乳糖;高效液相色譜

中圖分類號 S896文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）13-0042-03

蜂蜜是老少皆知的健康食品，依據(jù)花源的不同，可分為油菜花蜜、椴樹蜜、洋槐花蜜、棗花蜜等[1-6]。蜂蜜中的還原糖主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖5種，其常用的測定方法有菲林試劑法和高效液相色譜法。菲林試劑法對操作者要求較高，是一種常見的理化方法，而高效液相色譜法檢測準(zhǔn)確度高，也比較簡便。本研究采用高效液相色譜-示差折光的方法，對蜂蜜中5種還原糖含量進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 蜂蜜樣品（超市購買）、果糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、葡萄糖（aladdin，99.5%）、麥芽糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、蔗糖（Dr.Ehrenstorfer，99.5%）、乳糖（中國計(jì)量科學(xué)研究院，99.5%）;乙腈（色譜純，上海弗霓）。美國沃特士（Waters）e2695高效液相色譜并且配備了Waters 2414示差折光檢測器;本文所用的超純水由Synergy超純水機(jī)（美國密理博公司）自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件選擇 采用上海安譜公司產(chǎn)的CNW Athena NH2柱（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相采用乙腈（A有機(jī)相）和水（B無機(jī)相）比例為82∶18;檢測池溫度：35℃;柱溫：25℃;進(jìn)樣量5μL;流速1.0mL/min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取5種還原糖對照品，用超純水溶解配制成2.5，5，10，20，40mg/mL的混標(biāo)溶液，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取濾液備用，作為混合對照品溶液。

1.2.3 樣品溶液配制 在50℃水浴中加熱至蜂蜜樣品中結(jié)晶溶解攪拌均勻后，準(zhǔn)確稱取5g左右的樣品，置于100mL容量瓶中，加入水至刻度，取上清液過0.22μm濾膜，上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取5種糖混合對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，以儀器響應(yīng)值對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由圖1可知，相關(guān)系數(shù)都在0.99以上;5種糖在2.5～40mg/mL線性關(guān)系良好;并以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測得5種還原糖的檢出限為5mg/L。

2.2 精密度 精密吸取5種還原糖混合對照品溶液10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，并測定峰面積的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定結(jié)果見表1。由表1可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖精的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%、0.88%、1.03%、0.65%和1.72%。本實(shí)驗(yàn)測定5種還原糖含量的精密度良好，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3 重復(fù)性 取同一種蜂蜜樣品，按照1.2.3供試樣品溶液制備方法前處理，然后上機(jī)重復(fù)測定6次，記錄色譜圖，測定結(jié)果見表2。由表2可知，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.63%、2.84%、2.09%、0.13%、0.13%。表明用本方法測定5種還原糖含量重復(fù)性良好。

2.4 回收率 按照上面的測定方法和儀器條件，分別在蜂蜜樣品中添加對照品5.00和10.00mg的5種混合還原糖，進(jìn)行5種還原糖的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見表3。由表3可知，5種還原糖的回收率在90.95%～100.02%，并且重復(fù)測定5次，計(jì)算各組分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.43%～5.44%。表明高效液相色譜-示差折光法能夠滿足蜂蜜中5種還原糖含量需求。

2.5 樣品測定 取市場購買的5種蜂蜜樣品按照上面方法和條件進(jìn)行測試，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。由表4可知，蜂蜜中的還原糖主要是果糖和葡萄糖，蔗糖含量次之，另外蜂蜜中還含有微量的麥芽糖和乳糖。5種還原糖的HPLC色譜圖見圖2。由圖2可知，通過上述條件標(biāo)準(zhǔn)品中5種還原糖能夠達(dá)到很好的基線分離，5種還原糖的出峰時(shí)間在5～16min，結(jié)果令人滿意。

3 討論與結(jié)論

還原糖易溶于水，所以前處理直接用水定容，過微孔濾膜進(jìn)儀器檢測，檢測過程中主要是注意控制柱溫，示差折光檢測器對溫度要求很高，另外氨基柱的使用跟存放也需要注意，存放不當(dāng)會導(dǎo)致柱效降低。本實(shí)驗(yàn)針對蜂蜜中5種還原糖含量的測定，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和回收率，適用于蜂蜜中5種還原糖含量的測定。

參考文獻(xiàn)

[1]陳蘭珍，薛曉峰，陳芳，等.蜂蜜中還原糖組分測定的近紅外光譜應(yīng)用研究[J].食品科學(xué)，2009，30（8）：147-150.

[2]趙文惠，曾誠，叢媛媛，等.高效液相-示差折光法比較新疆產(chǎn)地8種蜂蜜中4種糖的含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2015，6（10）：4193-4198.

[3]袁夢，馬玉晨.效液相色譜-示差折光法測定蜂蜜中三種還原糖含量[J].食品與發(fā)酵科技，2015，51（1）：87-90.

[4]李水芳，張欣，李姣娟，等.拉曼光譜法無損檢測蜂蜜中的果糖和葡萄糖含量[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2014，30（6）：249-255.

[5]崔穎，肖亞兵，賀艷，等.蜂蜜中還原糖的測量不確定度評定[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（20）：133-137.

[6]蒲曉亞，杜旭升，劉泊，等.蜂蜜中果糖和葡萄糖含量測定問題的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（32）：147-148.

（責(zé)編：張宏民）