混合物料干濕厭氧發(fā)酵特性及菌群結(jié)構(gòu)

鄭訊濤　王樂(lè)樂(lè)　張?jiān)⒑堁笱蟆∨嗽葡?/p>

摘要：厭氧發(fā)酵是解決秸稈和畜禽糞等農(nóng)業(yè)廢棄物污染的重要途徑，為實(shí)現(xiàn)秸稈和牛糞的資源化利用，研究稻稈和牛糞混合物料干、濕厭氧發(fā)酵特性，并對(duì)混合物料發(fā)酵前后的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，稻稈與牛糞混合物料干、濕發(fā)酵的揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）均以乙酸和丙酸為主，發(fā)酵pH值均在5.6～7.7之間變化，濕發(fā)酵的總固體濃度（total solid，簡(jiǎn)稱TS）累積產(chǎn)甲烷量（63.8 mL/g）較干發(fā)酵（36.9 mL/g）提高73.90%，發(fā)酵前后菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群由消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）轉(zhuǎn)變?yōu)槠绽孜质暇≒revotellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）和互養(yǎng)菌（Synergistaceae），古菌的優(yōu)勢(shì)菌群由甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）和甲烷球菌（Methanosarcinaceae）轉(zhuǎn)變?yōu)橐砸宜岽x為主的甲烷球菌（Methanosarcinaceae）。

關(guān)鍵詞：稻稈;牛糞;混合物料;厭氧發(fā)酵;特性;菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： X71;S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0238-04

我國(guó)每年產(chǎn)生的秸稈和畜禽糞達(dá)到8.00、32.64億t[1]，如果未能妥善處理，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大危害。以秸稈與畜禽糞混合為底物進(jìn)行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，既可解決農(nóng)村畜禽糞處理原料不足問(wèn)題，也可緩解環(huán)境污染壓力，還能實(shí)現(xiàn)清潔能源的生產(chǎn)[2-3]。目前秸稈與畜禽糞的厭氧發(fā)酵多采用濕式厭氧發(fā)酵形式，該方法耗水量大，沼液產(chǎn)生量多[4]，后續(xù)處理不便。干發(fā)酵由于其發(fā)酵過(guò)程需水量較少，發(fā)酵后無(wú)沼液產(chǎn)生、沼渣可用于直接制有機(jī)肥、減少二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到普遍關(guān)注[5-6];但單純的畜禽糞干發(fā)酵，由于物料氨態(tài)氮含量高，發(fā)酵系統(tǒng)易產(chǎn)生氨中毒現(xiàn)象[7-8]，而且物料較差的透氣性和傳質(zhì)性能也使發(fā)酵系統(tǒng)效率較低[9]。單一秸稈干發(fā)酵仍須添加額外氮源以防止酸化現(xiàn)象[10];將畜禽糞與秸稈混合進(jìn)行干發(fā)酵既可改善發(fā)酵體系中的C/N平衡，降低發(fā)酵過(guò)程中氨抑制的風(fēng)險(xiǎn)，又可通過(guò)秸稈的疏松結(jié)構(gòu)改善原料間的接觸面、增強(qiáng)物料的傳質(zhì)性能。在發(fā)酵中微生物菌群對(duì)沼氣的生產(chǎn)發(fā)揮了重要作用[11-12]，分析厭氧發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群的結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物的變化有助于了解發(fā)酵系統(tǒng)的運(yùn)行狀態(tài)，便于改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高發(fā)酵系統(tǒng)的厭氧消化效率及產(chǎn)氣量。為此，本研究將鮮牛糞與稻稈按比例混合，研究混合物料高含固率的濕發(fā)酵總固體濃度（total solid，簡(jiǎn)稱TS）（TS=10%）與干發(fā)酵（TS=25%）的厭氧消化特性，并對(duì)發(fā)酵潛力好的一組細(xì)菌和古菌微生物菌群進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，研究發(fā)酵前后微生物菌群的結(jié)構(gòu)及功能變化，以期通過(guò)厭氧發(fā)酵途徑為秸稈和畜禽糞的資源化利用提供可靠技術(shù)支持。

1材料與方法

試驗(yàn)于2016年11月至2017年3月在西南大學(xué)廢棄物資源化利用實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1試驗(yàn)材料

鮮牛糞取自重慶市北碚區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng);稻稈取自重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)某稻田，稻稈已在田間自然風(fēng)干半年，試驗(yàn)前去掉稻穗，并將稻稈剪至1～2 cm的小段。試驗(yàn)材料的理化性質(zhì)如表1所示。

1.2試驗(yàn)裝置與試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用自制的發(fā)酵裝置（圖1），主要由2.5 L的發(fā)酵瓶、加熱與溫控裝置、循環(huán)泵、集氣量筒、導(dǎo)氣管等組成。發(fā)酵罐溫度通過(guò)外部?jī)?chǔ)水箱水加熱后泵送至發(fā)酵罐保溫層，以保持恒溫（35±1） ℃，產(chǎn)氣量由排水法收集。試驗(yàn)設(shè)置干發(fā)酵組和濕發(fā)酵組，2組試驗(yàn)發(fā)酵原料總質(zhì)量均為800 g，總固體濃度分別為10%、25%，試驗(yàn)中稻稈與鮮牛糞按照干物質(zhì)比 1 ∶1 添加，厭氧發(fā)酵前先通入5 min氮?dú)庖猿グl(fā)酵瓶?jī)?nèi)的氧氣。

1.3分析方法

總固體含量采用烘干法測(cè)定;揮發(fā)性固體（volatile solid，簡(jiǎn)稱VS）采用馬弗爐灼燒法測(cè)定[13];pH值采用精密pH計(jì)（Sartorius-10型）測(cè)定;揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，簡(jiǎn)稱VFAs）采用高效液相色譜儀（LC2010）測(cè)定;纖維素酶活性采用DNS比色法測(cè)定[14];酶活性單位定義：1 mL發(fā)酵液在一定pH值和溫度下在1 min內(nèi)催化底物生成1 μmol的葡萄糖為1個(gè)酶活單位，用U表示;總產(chǎn)氣量采用排水法測(cè)定，甲烷含量采用GC9720型氣相色譜儀進(jìn)行分析測(cè)定[15]。

1.4微生物多樣性的測(cè)定

1.4.1總DNA的提取

取搖勻后的1.5 mL發(fā)酵液，過(guò)濾，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物用于總DNA提取。總DNA的提取按照試劑盒（OMEGA Soil DNA Kit）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，并利用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量分析。

1.4.2微生物菌群結(jié)構(gòu)檢測(cè)

試驗(yàn)選用長(zhǎng)度約為250 bp的細(xì)菌16S rRNA基因高度可變的V4區(qū)和長(zhǎng)度為420 bp的古菌16S rRNA基因高度可變的V4V5區(qū)測(cè)序。PCR擴(kuò)增選用細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)特異性引物，520F（5′-barcode+[JP9]AYTGGGYDTAAAGNG-3′）、802R（5′-[JP9]TACNVGGGTATCTAATCC-3′）;古菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增選用的引物為519F（5′-[JP9]CAGCCGCCGCGGTAA-3′）、915R（5′-[JP9]GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：0.25 μL Q5 high-fidelity DNA聚合酶，5 μL 5×Reaction Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（10 mmol/L），2 μL DNA模板，1 μL正向引物（10 μmol/L），1 μL 反向引物（10 μmol/L），加水補(bǔ)足至 25 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性15 s，50 ℃ 退火30 s;72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)片段采用上海百賽生物技術(shù)股份有限公司（Axygen）的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。文庫(kù)的制備和高通量測(cè)序由測(cè)序公司進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1干、濕發(fā)酵過(guò)程中VFAs與pH值的變化

pH值和VFAs對(duì)厭氧消化產(chǎn)沼氣有重要影響[16-17]。由圖2可知，在稻稈與牛糞混合物料的干、濕發(fā)酵中，VFAs與pH值的變化存在較大差異。干發(fā)酵的pH值在發(fā)酵10 d時(shí)降至最低，隨后處于逐漸升高狀態(tài)，而VFAs達(dá)到峰值的時(shí)間滯后于pH值降低的時(shí)間，但濕發(fā)酵的pH值降低與VFAs的升高同步。在稻桿與牛糞混合物料的干、濕發(fā)酵中，總VFAs均以乙酸和丙酸為主，甲酸和丁酸的含量相對(duì)較少，且乙酸含量隨發(fā)酵時(shí)間均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在干發(fā)酵中，乙酸的平均濃度占總VFAs的44.4%，明顯高于濕發(fā)酵的30.5%，丙酸的平均濃度為2.85 g/L，高于產(chǎn)甲烷菌對(duì)丙酸的耐受濃度1.0 g/L[18]，所以在干發(fā)酵后期出現(xiàn)了丙酸積累。濕發(fā)酵進(jìn)行到40 d時(shí)，丙酸含量累積到5.04 g/L，遠(yuǎn)超過(guò)產(chǎn)甲烷菌的耐受能力，但由于此時(shí)甲酸、乙酸、丁酸濃度很低，加之濕發(fā)酵較好的傳質(zhì)能力，產(chǎn)甲烷菌能夠間接利用丙酸進(jìn)行代謝[19]，使丙酸含量迅速降低，所以雖然發(fā)酵結(jié)束丙酸含量占總VFAs的90%，但系統(tǒng)并沒(méi)有出現(xiàn)酸化現(xiàn)象。

2.2干、濕發(fā)酵過(guò)程中酶活性的變化

混合發(fā)酵物料中含有半纖維素、纖維素、木質(zhì)素，纖維素酶活性在一定程度上反映了發(fā)酵底物的降解效率。由圖3可知，復(fù)合酶系的3種酶均參與混合物料的發(fā)酵水解，均呈先升高后降低的趨勢(shì)，并且在3種酶中酶活性最高的是內(nèi)切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶，外切葡聚糖酶雖在發(fā)酵中期有較大活性，但低于內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活。干、濕發(fā)酵的濾紙總酶活性在發(fā)酵的前20 d整體呈上升趨勢(shì)，并在20 d時(shí)達(dá)到峰值1.68、1.40 U/TS，隨后整體呈下降趨勢(shì)。

2.3干、濕發(fā)酵過(guò)程中日產(chǎn)氣量與累積產(chǎn)氣量的變化

由圖4-a可知，混合物料干發(fā)酵與濕發(fā)酵在最初5 d均經(jīng)歷了1個(gè)小的產(chǎn)氣高峰（320、415 mL），但此時(shí)氣體成分中甲烷含量均較低（圖4-b）。濕發(fā)酵在30、41 d時(shí)出現(xiàn)了2次產(chǎn)氣高峰，產(chǎn)氣量分別達(dá)到765、635 mL，干發(fā)酵在28 d時(shí)產(chǎn)氣量開(kāi)始增加，43 d時(shí)達(dá)到產(chǎn)氣高峰909 mL，之后逐漸下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，濕發(fā)酵累積TS甲烷產(chǎn)量為63.8 mL/g，較干發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量高73.2%（圖4-b）。為此，對(duì)濕發(fā)酵的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2.4混合物料濕發(fā)酵中微生物菌群分布

由圖5可知，厭氧發(fā)酵前后，細(xì)菌和古菌在菌群豐度上發(fā)生了較大的變化。在發(fā)酵初期（發(fā)酵5 d），細(xì)菌中消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）、理研菌（Rikenellaceae）是優(yōu)勢(shì)菌群，分別占27.6%、15.8%、12.6%、6.7%;經(jīng)厭氧消化后，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、克里斯騰森菌（Christensenellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）、互養(yǎng)菌（Synergistaceae）較發(fā)酵初期分別提高16.4%、13%、7%、5.8%，成為產(chǎn)氣高峰（發(fā)酵40 d）的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群。古菌中，發(fā)酵初期（發(fā)酵5 d）的產(chǎn)甲烷菌主要有甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）與甲烷球菌（Methanosarcinaceae），它們的豐度差別不大，分別占菌群總數(shù)的 16.2%、17.5%，但發(fā)酵進(jìn)行至產(chǎn)氣高峰（發(fā)酵40 d）后，甲烷球菌成為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度達(dá)到33.8%，而甲烷桿菌降至9.2%。

3討論

糖類是厭氧發(fā)酵過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，是多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在發(fā)酵底物主要為木質(zhì)纖維素時(shí)，糖類的產(chǎn)生主[CM（25]要依賴于微生物分泌的纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素的水解作用。試驗(yàn)中，發(fā)酵前期纖維素酶活性逐漸升高，通過(guò)菌群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)能夠分泌纖維素酶的瘤胃菌（Ruminococcaceae）[20-21]、能夠利用木聚糖和淀粉等物質(zhì)的普雷沃氏菌（Prevotellaceae）[22]、克里斯騰森菌（Christensenellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）及互養(yǎng)菌（Synergistaceae）成為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)，能夠通過(guò)糖酵解平臺(tái)水解產(chǎn)生VFAs的梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）也是優(yōu)勢(shì)菌群[23-24]，因此發(fā)酵前期VFAs的含量隨纖維素酶活性升高而增加。在發(fā)酵中后期，利用H2/CO2、甲酸鹽、2-丙醇/CO2、2- 丁醇/CO2的甲烷桿菌[25]豐度大幅下降，利用乙酸和甲醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[26]的甲烷球菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，VFAs中的乙酸被甲烷球菌利用產(chǎn)生甲烷，所以此時(shí)發(fā)酵系統(tǒng)中，乙酸含量幾乎為0，而甲烷含量逐漸增加。研究表明，只有當(dāng)發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的氫分壓穩(wěn)定在 0.1～10.1 Pa范圍內(nèi)時(shí)，丙酸的降解才會(huì)發(fā)生[27]，但發(fā)酵后期氫養(yǎng)型甲烷短桿菌的豐度大幅下降，不能維持系統(tǒng)內(nèi)較低的氫分壓，這可能是丙酸積累的重要原因。

4結(jié)論

稻稈與牛糞混合物料在干、濕發(fā)酵過(guò)程中，VFAs均以乙酸和丙酸為主，甲酸和丁酸含量相對(duì)較低，pH值為5.6～7.7，發(fā)酵系統(tǒng)沒(méi)有出現(xiàn)酸化現(xiàn)象，濕發(fā)酵的累積TS甲烷產(chǎn)量（63.8 mL/g）較干發(fā)酵（36.9 mL/g）提高72.90%。稻稈與牛糞混合物料的濕發(fā)酵以甲烷球菌（Methanosarcinaceae）的乙酸代謝為主，發(fā)酵前后，微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。發(fā)酵初期，細(xì)菌菌群以消化鏈球菌（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌（Ruminococcaceae）、梭菌（Clostridiaceae.1）和理研菌（Rikenellaceae）為主，甲烷桿菌（Methanobacteriaceae）與甲烷球菌（Methanosarcinaceae）為古菌優(yōu)勢(shì)菌群，厭氧發(fā)酵后，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群轉(zhuǎn)變?yōu)槠绽孜质暇≒revotellaceae）、毛螺菌（Lachnospiraceae）和互養(yǎng)菌（Synergistaceae），古菌則以甲烷球菌（Methanosarcinaceae）為主。

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