康業(yè) 李滬 徐冉 張磊 趙曉昆 王蔭槐 朱煊

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，男性的發(fā)病率約為女性的4倍[1]。膀胱癌一直是治療難度較大的惡性腫瘤之一[2]，盡管在了解其分子發(fā)病機(jī)制方面取得了很大進(jìn)展，但關(guān)于膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制仍有待闡明。早期研究表明，膀胱癌的基因突變主要集中在染色質(zhì)重塑和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期途徑的基因上[3]，如TP53[4]、HRAS[5]、FGFR3[6]等。隨著研究的不斷深入，許多長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要因素之一[7-9]。

CircRNAs是一類內(nèi)源性調(diào)節(jié)非編碼RNA，通過從許多真核基因的前體mRNA反向環(huán)化產(chǎn)生[10]。此類RNA通常以低水平轉(zhuǎn)錄，但它們的轉(zhuǎn)錄在各種細(xì)胞和組織中廣泛存在[11-13]。本研究中，我們將重點(diǎn)鑒定膀胱癌中差異表達(dá)的circRNA。膀胱癌可因侵襲程度的不同分為肌層浸潤與非肌層浸潤兩種，其中肌層浸潤性膀胱癌約占膀胱腫瘤的30%[1-2]，其術(shù)后復(fù)發(fā)率和死亡率要遠(yuǎn)高于非肌層浸潤性膀胱癌。針對這一分類進(jìn)行研究，將有助于了解膀胱癌侵襲能力變化的機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.標(biāo)本來源：選取2018年1月至2019年1月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診確診為膀胱癌，并行手術(shù)治療的患者。依據(jù)研究目標(biāo)設(shè)定入選標(biāo)準(zhǔn)：初發(fā)的膀胱癌；術(shù)前未行新輔助化療；隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病檢為非尿路上皮癌；復(fù)發(fā)性膀胱癌；術(shù)后隨訪時(shí)間不連續(xù)，隨訪資料不完整。在circRNA測序階段，3組癌旁、非肌層浸潤癌組織及肌層浸潤癌組織分別來自3例不同的患者。3組標(biāo)本的獲取流程：選取因膀胱多發(fā)腫瘤行膀胱全切的患者，每處腫瘤均取材2份，1份于-80 ℃保存，1份于10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色后，病理閱片，篩選出同時(shí)具有非肌層浸潤和肌層浸潤的病例3組，連同相應(yīng)癌旁標(biāo)本，進(jìn)入測序?qū)嶒?yàn)階段。驗(yàn)證階段，10例非肌層浸潤癌組織及10例肌層浸潤癌組織分別來自于不同的20例膀胱癌患者，樣本清潔處理后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。本研究中，共收集23例膀胱尿路上皮癌患者組織及相應(yīng)的臨床、病理數(shù)據(jù)。本研究獲得中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集患者組織前均充分告知患者，并與患者簽署知情同意書。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：檢測引物合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA-seq測序委托上海若谷生物科技有限公司(BIOAIDE)進(jìn)行；Trizol購自美國Invitrogen公司；qPCR試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國 Gibco公司；人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1和4種膀胱癌細(xì)胞系(T24、J82、5637、SW780)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并經(jīng)STR鑒定正確；Transwell孔板小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司。

二、病理組織學(xué)檢查

整理收集到的膀胱癌組織，截取部分組織使用10%的甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋與切片。對組織切片進(jìn)行HE染色后封片烤干，在光學(xué)顯微鏡下觀察，確定腫瘤的病理分期和分級，并進(jìn)行記錄與分類。所有標(biāo)本病理診斷均由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院病理科完成。

三、轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)測序公司方案，選取9例臨床組織(癌旁組織、非肌層浸潤癌組織、肌層浸潤癌組織各3例)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。使用Trizol分離臨床樣本的總RNA。用NanoDrop定量提取的RNA，確定RNA質(zhì)量合格。干冰保存運(yùn)輸送交上海若谷生物科技有限公司(BIOAIDE)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

對原始RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析質(zhì)控。去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和有偏差的數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)控；然后將RNA-seq數(shù)據(jù)比對到參考基因組序列；將測序得到的reads比對到參考基因組序列上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，進(jìn)而得到基因的表達(dá)量結(jié)果。使用ACFS2軟件進(jìn)行circRNA的檢測、鑒定以及定量circRNA豐度。

根據(jù)樣本類型對表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，由此提取差異顯著的circRNA。本次差異篩選算法以及標(biāo)準(zhǔn)化方式如下：顯著差異基因的算法：DESeq2-Counts(Needs Rep)；篩選標(biāo)準(zhǔn)：log2FC>0，P>0.01。分析比較組：肌層浸潤癌組織vs非肌層浸潤癌組織；非肌層浸潤癌組織vs癌旁組織；肌層浸潤癌組織vs癌旁組織。

統(tǒng)計(jì)符合差異標(biāo)準(zhǔn)的基因，進(jìn)行分類篩選與統(tǒng)計(jì)。重點(diǎn)分析肌層浸潤癌組織vs非肌層浸潤癌組織的顯著差異circRNA，結(jié)合已有研究內(nèi)容，篩選與膀胱癌侵襲相關(guān)性高的circRNA。

四、qPCR檢測circRNA在臨床組織樣本中的表達(dá)差異

為了進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組circRNA測序中差異表達(dá)的circRNA結(jié)果，采用Trizol法提取20例樣本組織(10例非肌層浸潤膀胱癌組織、10例肌層浸潤膀胱癌組織)的總RNA，經(jīng)檢測RNA濃度與純度均達(dá)標(biāo)，進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過SYBR Green在20 μl含有2 μl cDNA、0.5 μmol/L正向引物和0.5 μmol/L反向引物的反應(yīng)中進(jìn)行定量RT-PCR。PCR設(shè)定在95 ℃下10 min預(yù)變性，40個(gè)循環(huán) (95 ℃ 10 s和60 ℃ 60 s)。PCR檢測一式3份同時(shí)進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算circRNA的相對表達(dá)水平。

設(shè)計(jì)3種circRNA(circST6GALNAC6、circPRUNE2、circMYH11)、內(nèi)參基因GAPDH的qPCR檢測引物。引物信息見表1。

表1 circRNA qPCR檢測引物信息

五、細(xì)胞培養(yǎng)與本底circRNA表達(dá)水平檢測

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境均為37 ℃、5% CO2。人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1使用F12K培養(yǎng)液(10%胎牛血清)培養(yǎng)，人膀胱癌細(xì)胞T24使用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)培養(yǎng)，J82使用MEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)培養(yǎng)，5637與SW780在RPMI-1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清)中培養(yǎng)。

將上述細(xì)胞于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，定期查看培養(yǎng)狀況與密度。選取生長狀況良好、60%～70%密度的培養(yǎng)孔收集細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照膀胱癌組織qPCR檢測體系與條件(方法四)，檢測細(xì)胞中circRNA的相對表達(dá)水平。

六、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測膀胱癌細(xì)胞侵襲能力

準(zhǔn)備好基質(zhì)膠、無血清培養(yǎng)液與完全培養(yǎng)液?；|(zhì)膠和無血清培養(yǎng)液的比例按1∶5稀釋后取60 μl均勻鋪在24孔板Transwell上室。將4種膀胱癌細(xì)胞用胰酶消化后，加入無血清培養(yǎng)液重懸，在單孔Transwell上室中加入200 μl懸液，下室加入600 μl完全培養(yǎng)液，每種細(xì)胞設(shè)3孔重復(fù)。培養(yǎng)48 h后，取出小室，清洗固定后進(jìn)行結(jié)晶紫溶液染色。光學(xué)顯微鏡觀察，3個(gè)視野/孔，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差展示，兩組樣本間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、病理組織檢查結(jié)果

通過組織學(xué)觀察確定病理組織情況，HE染色觀察癌旁組織、非肌層浸潤癌組織和肌層浸潤癌組織，見圖1。

二、轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

針對不同的轉(zhuǎn)錄組測序分析比較組別，統(tǒng)計(jì)整體顯著性差異基因，詳見表2。

圖1 3種膀胱癌組織病理切片(HE染色，×100)

比較組所有差異基因數(shù)目顯著性上調(diào)基因數(shù)目顯著性下調(diào)基因數(shù)目肌層浸潤癌組織vs非肌層浸潤癌組織40 68821095非肌層浸潤癌組織vs癌旁組織38 971300581肌層浸潤癌組織vs癌旁組織37 9579978

注：差異基因數(shù)目為所有可統(tǒng)計(jì)的差異circRNA基因數(shù)目；顯著性上、下調(diào)數(shù)目為經(jīng)篩選標(biāo)準(zhǔn)(log2FC>0，P>0.01)篩選后的差異基因數(shù)目

肌層浸潤與非肌層浸潤膀胱癌組織的circRNA測序結(jié)果相比，有305個(gè)具顯著性差異的circRNA，210個(gè)circRNA顯著性上調(diào)，而95個(gè)circRNA在肌層浸潤膀胱癌組織中顯著下調(diào)。綜合分析表明，失調(diào)的circRNA可能參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。為了解影響膀胱癌侵襲能力的關(guān)鍵circRNA，發(fā)現(xiàn)膀胱癌的新生物標(biāo)志物，分析肌層浸潤膀胱癌組織與非肌層浸潤膀胱癌組織的測序數(shù)據(jù)，結(jié)合已有文獻(xiàn)，挑選出3種候選circRNA，見表3。

表3 肌層浸潤癌組織vs非肌層浸潤癌組織差異候選circRNA

注：Log2FC:肌層浸潤癌組織與非肌層浸潤癌組織信號值差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)；P值:差異顯著性水平，P值越小表示基因差異越顯著

候選circRNA中，ST6GALNAC6屬于唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族，其通過修飾細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)和神經(jīng)酰胺來改變細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互作用，與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。這一生理過程是上皮細(xì)胞類惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵；MYH11基因編碼的蛋白質(zhì)是平滑肌肌球蛋白，在癌癥中與侵襲能力相關(guān)；PRUNE2基因編碼的蛋白質(zhì)在許多細(xì)胞過程中起作用，包括凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和突觸功能。

三、qPCR驗(yàn)證circRNA表達(dá)水平差異

統(tǒng)計(jì)分析10例非肌層浸潤癌組織樣本和10例肌層浸潤癌組織樣本中3種候選circRNA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，circST6GALNAC6與circMYH11在肌層浸潤癌組織中的表達(dá)水平顯著高于非肌層浸潤癌組織(P<0.01)；circPRUNE2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測為樣本數(shù)據(jù)間方差過大所致，見圖2。

四、臨床數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)各臨床參數(shù)下的3種候選circRNA表達(dá)水平，記錄樣本數(shù)目，結(jié)果見表4。

圖2 qPCR檢測不同膀胱癌組織之間3種circRNA的表達(dá)差異(*P<0.05，**P<0.01，ns-差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

臨床參數(shù)樣本數(shù)circST6GALNAC6高表達(dá)(n=9)低表達(dá)(n=11)P值circPRUNE2高表達(dá)(n=11)低表達(dá)(n=9)P值circMYH11高表達(dá)(n=12)低表達(dá)(n=8)P值年齡(歲)0.906 70.910 10.721 3 ≤55 624 >55147733864286性別(例)0.905 20.905 20.845 2 男1789 女312982110721腫瘤大小(cm)0.005 1*0.609 10.035 0* >2972 ≤2 112945748147病理分期(例)0.001 2*0.631 60.027 1* 非肌層浸潤1019 肌層浸潤108246733791病理分級(例)0.024 1*0.874 00.009 0* 低級別817 高級別1284536626102

注：假設(shè)年齡>55歲、男性、腫瘤大小>2 cm、肌層浸潤膀胱癌、高級別病理分級參數(shù)下circRNA表達(dá)水平更高，表中的*P<0.05表明各臨床指標(biāo)與表達(dá)水平相關(guān)性假設(shè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05表明臨床指標(biāo)與表達(dá)水平相關(guān)性假設(shè)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

五、正常膀胱細(xì)胞與膀胱癌細(xì)胞之間circRNA表達(dá)的差異

與人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1相比，4種膀胱癌細(xì)胞系的circST6GALNAC6與circMYH11表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。4種膀胱癌細(xì)胞系中circST6GALNAC6的表達(dá)水平從高到低排列為J82≈T24>5637>SW780；circMYH11的表達(dá)水平從高到低排列為J82≈T24>5637≈SW780。膀胱癌細(xì)胞系J82的circPRUNE2表達(dá)水平與SV-HUC-1相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3種膀胱癌細(xì)胞系中表達(dá)水平從高到低排列為SW780>5637>T24，見圖3。

六、Transwell檢測膀胱癌細(xì)胞間的侵襲能力差異

分析Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，J82細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為(106.00±5.29)個(gè)，T24侵襲細(xì)胞數(shù)為(86.67±6.43)個(gè)，5637侵襲細(xì)胞數(shù)為(40.67±5.86)個(gè)，SW780侵襲細(xì)胞數(shù)為(38.00±5.29)個(gè)。4種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有一定差異，從高到低排列為J82>T24>5637≈SW780，見圖4。

圖3 qPCR檢測不同細(xì)胞之間3種circRNA的表達(dá)差異(*P<0.05，**P<0.01，ns-差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

圖4 Transwell檢測4種膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力差異

討 論

為了驗(yàn)證關(guān)鍵circRNA參與調(diào)控膀胱癌侵襲能力的假設(shè)，系統(tǒng)地分析肌層浸潤與非肌層浸潤癌組織樣本轉(zhuǎn)錄組測序中差異表達(dá)的circRNA，選出了3個(gè)候選circRNA(circST6GALNAC6、circPRUNE2、circMYH11)。通路分析表明這3個(gè)circRNA來源于與癌癥分化或侵襲相關(guān)的基因，癌癥的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移受這些circRNA調(diào)節(jié)的可能性很大。

通過qPCR 檢測20例膀胱癌組織樣本中3個(gè)候選circRNA的相對表達(dá)水平，結(jié)果表明circST6GALNAC6、circMYH11在肌層浸潤癌組織中的相對表達(dá)水平顯著高于非肌層浸潤癌組織(P<0.01)；部分樣本中circPRUNE2表達(dá)水平隨膀胱癌侵襲性加強(qiáng)而上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。對比分析20例膀胱癌的臨床及病理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，circST6GALNAC6與circMYH11的表達(dá)水平與性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P>0.01)，與腫瘤大小、病理分期和分級具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P<0.05)，且與circRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)。circPRUNE2的表達(dá)水平與臨床和病理數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，推測其與膀胱癌的侵襲能力變化和病理變化不具相關(guān)性。

選取人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1為參照，檢測4種膀胱癌細(xì)胞系的circRNA表達(dá)水平。4種膀胱癌細(xì)胞系中circST6GALNAC6的表達(dá)水平從高到低排列為J82≈T24>5637>SW780；circMYH11的表達(dá)水平從高到低排列為J82≈T24>5637≈SW780；circPRUNE2的表達(dá)水平從高到低排列為SW780>5637>T24。針對這4種膀胱癌細(xì)胞系進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測4種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力從高到低排列為J82>T24>5637≈SW780。由此發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞系中circST6GALNAC6與circMYH11的表達(dá)水平變化與細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)，從細(xì)胞水平證明了這兩種circRNA與膀胱癌細(xì)胞侵襲的能力存在相關(guān)性。

本研究初步確認(rèn)circST6GALNAC6與circMYH11兩種circRNA的上調(diào)與膀胱癌的侵襲可能有關(guān)。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究circRNA調(diào)控膀胱癌中侵襲過程的部分機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

因在多種生物樣本(如唾液和血液)中都能檢測到circRNA，circRNA能作為癌癥發(fā)展、治療和預(yù)后的潛在診斷指標(biāo)或預(yù)測性生物標(biāo)志物。CircRNAs的組織特異性和疾病相關(guān)表達(dá)模式通常具有一定的關(guān)聯(lián)性，這表明它們對疾病可能造成影響[14]。目前已有研究證明特定circRNA的水平在致癌增殖期間發(fā)生顯著改變[14]。其作用機(jī)制主要是circRNA可作為microRNA的海綿，并提升對靶mRNA表達(dá)的抑制作用，引起細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變[15]。例如，circRNA-circHIPK3-microRNA-miR-558抑制乙酰肝素酶的表達(dá)，并負(fù)調(diào)節(jié)膀胱癌的進(jìn)展[16]。因此，circRNA的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)途徑變化，其涉及多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞增殖的失調(diào)等致癌變化。

本研究中的兩種circRNA可作為診斷和預(yù)后預(yù)測的候選指標(biāo)，但其臨床意義尚需通過系統(tǒng)的生物學(xué)研究來確定。在未來的研究中，我們將進(jìn)一步評估和驗(yàn)證這些circRNA在較大臨床樣本群組中的表達(dá)模式，以確認(rèn)其作為臨床生物標(biāo)志物的可行性。