魏磊 常霞 全彥濤

摘要：鯊烯合酶（squalene synthase，EC2.5.1.21，簡稱SQS）是三萜類化合物生物合成通路的關(guān)鍵酶之一。采用生物信息學(xué)方法對(duì)13種五加科植物的SQS核苷酸及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、親/疏水性、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能域、三級(jí)結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行初步預(yù)測(cè)和分析，并構(gòu)建SQS蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，13種五加科植物的SQS氨基酸序列結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)基本一致，均表現(xiàn)出親水性，沒有信號(hào)肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位分析顯示，除Panax sokpayensis定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其余均定位于質(zhì)膜上。α螺旋和無規(guī)則卷曲為SQS二級(jí)結(jié)構(gòu)中最主要的結(jié)構(gòu)元件，保守區(qū)包括底物結(jié)合區(qū)、鎂離子結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)殘基蓋、催化殘基和2個(gè)天冬氨酸富集區(qū)，具有典型的多聚異戊二烯基合成酶活性結(jié)構(gòu)域和鯊烯/八氫番茄紅素合成酶活性結(jié)構(gòu)域。分析結(jié)果可為SQS的酶學(xué)特性及三萜類化合物生物合成的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：五加科;生物信息學(xué);鯊烯合酶;三萜生物合成

中圖分類號(hào)：S188?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0057-06

三萜類化合物由6個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)單元組成，以共同前體鯊烯（squalene）為底物，在不同三萜合酶的催化下形成的C30類萜類化合物，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中。在植物界，三萜類化合物在五加科、豆科、大戟科、衛(wèi)矛科等科屬中廣泛存在，且具有抗癌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、溶血、抗菌、抗病毒等重要的藥理活性[1]。在植物三萜合成通路（圖1）中，鯊烯合酶（squalene synthase，簡稱SQS）處于法尼基焦磷酸（FPP）到其他產(chǎn)物（二萜、四萜等）的分支點(diǎn)上，催化2分子FPP縮合生成1分子鯊烯，而鯊烯是三萜、甾醇等萜烯類物質(zhì)生物合成的共同前體，因此，SQS是三萜類化合物生物合成通路中的關(guān)鍵酶[2]。

至今，多種植物的SQS已經(jīng)或正在被深入研究，包括銀杏（Ginkgo biloba，GeneBank：APB03419.1）、紫杉（Taxus cuspidata，GenBank：ABI14439.1）等裸子植物及以煙草（Nicotiana tabacum，GeneBank：AAB08578.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，GeneBank：AAD00296.1）為代表的被子植物。Floressánchez等用果膠處理貓掌樹懸浮細(xì)胞，使得SQS活性提高了3倍以上，進(jìn)而增加了萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量[3];Han等通過誘導(dǎo)睡茄鯊烯合酶的表達(dá)，能夠提高植物甾醇的含量[4];而張毅等反義抑制煙草SQS，降低了植物甾醇的生物合成[5];Patel等抑制人參鯊烯合酶的表達(dá)，可使三萜皂苷的生成量降低[6]。以上研究均表明，對(duì)植物SQS進(jìn)行調(diào)控可改變后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

五加科（Araliaceae）植物多為古老而又名貴的藥用植物，通常其體內(nèi)三萜類化合物含量豐富，活性顯著，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)，如具有大補(bǔ)元?dú)?、固脫、生津、安神和益智功效的人參（Panax ginseng）[7]，活血止血、消腫定痛、金刀跌傷的三七（P. notoginseng）[8]，補(bǔ)氣安神、強(qiáng)精滋腎、祛風(fēng)除濕、活血止痛的楤木（Aralia elata）[9]等。目前，已從五加科人參、三七、楤木、刺五加（Eleutherococcus senticosus）、西洋參（P. quinquefolius）等中藥材中克隆到了SQS的基因。鯊烯合酶作為植物三萜類化合物生物合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，受到越來越多的關(guān)注，本研究利用生物信息學(xué)方法，篩選出五加科植物中已被克隆的13個(gè)SQS蛋白，對(duì)其核苷酸及編碼的氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、親/疏水性、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期為更多物種SQS蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，簡稱NCBI）下載并篩選出了五加科植物人參、三七、西洋參、刺五加、竹節(jié)參（Panax japonicus）、楤木和P. sokpayensis的13種完整的SQS核苷酸和氨基酸序列（表1）。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

2.1 五加科植物SQS核苷酸及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

利用ORF Finder和ProtParam在線網(wǎng)站對(duì)13種五加科植物SQS核苷酸及其編碼氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。由表2可知，SQS核苷酸序列的起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TGA;氨基酸殘基數(shù)（amino acids，aa）在414～446個(gè)之間;各蛋白相對(duì)分子質(zhì)量在46 923.26～51 063.97 ku 之間，中位值為47 067.53 ku;理論等電點(diǎn)范圍為5.96～6.67，平均為6.28，說明SQS為酸性蛋白。從氨基酸組成可以看出，13種SQS蛋白所含酸性氨基酸殘基比例均高于堿性氨基酸，進(jìn)一步說明SQS為酸性蛋白。各種植物SQS蛋白中，含量最豐富的氨基酸殘基主要集中在亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、賴氨酸（Lys）和異亮氨酸（Ile）上。除P. sokpayensis外，其余12種五加科植物總原子數(shù)和消光系數(shù)基本一致。人參2、人參3、西洋參1、西洋參3、刺五加1、刺五加2不穩(wěn)定系數(shù)低于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。

2.2 五加科植物SQS蛋白的磷酸化位點(diǎn)

利用NetPhos 3.1 Server對(duì)13種五加科植物SQS蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，磷酸化位點(diǎn)在17～20個(gè)之間。以楤木SQS蛋白為例，超過閾值（Threshold）0.5判定為磷酸化位點(diǎn)，共有36個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖2），其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)20個(gè)，分別為S3、S48、S50、S126、S134、S187、S196、S198、S232、S234、S249、S215、S329、S344、S358、S370、S374、S378、S385、S408;蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，分別為T78、T83、T112、T161、T296、T318、T327、T366、T372;酪氨酸磷酸化位點(diǎn)7個(gè)，分別為Y15、Y136、Y168、Y236、Y245、Y273、Y332。除個(gè)別位點(diǎn)以外，其余植物SQS蛋白磷酸化位點(diǎn)與楤木基本一致。

2.3 五加科植物SQS的親/疏水性、信號(hào)肽、導(dǎo)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位特征

2.3.1 蛋白親/疏水性的預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)親/疏水性氨基酸組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力[10]，利用Protscale在線預(yù)測(cè)親疏水性，以楤木SQS為例，其多肽鏈中第351位氨基酸有最低的親水性分值-2.433，位于395和398位的氨基酸有最高的疏水性分值3.567。其中，親、疏水性氨基酸分別占55.4%和 44.6%，推測(cè)折疊的蛋白為親水性蛋白。此外，肽鏈兩端為親水性氨基酸，中間有2段疏水性氨基酸，這與跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。其余12種SQS的親/疏水性分析結(jié)果都與楤木相似。

2.3.2 信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析 信號(hào)肽是新合成的多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端的氨基酸序列，一般由16～26個(gè)氨基酸組成，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而信號(hào)肽自身的序列在信號(hào)肽酶的作用下被切除[11]。利用在線工具Signal P 4.1 Server的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)13種五加科植物的SQS蛋白進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明均不存在信號(hào)肽。

2.3.3 導(dǎo)肽的預(yù)測(cè)和分析 導(dǎo)肽又稱轉(zhuǎn)運(yùn)肽，大約18～20個(gè)氨基酸長度，位于新合成蛋白質(zhì)的N端，其含有豐富的堿性氨基酸，這些氨基酸對(duì)于蛋白質(zhì)的定位具有重要的作用[12]，能將肽鏈準(zhǔn)確地定位于細(xì)胞的某一個(gè)細(xì)胞器或組織上[13]。因此，對(duì)導(dǎo)肽的預(yù)測(cè)分析有助于蛋白質(zhì)的功能和作用機(jī)制研究。通過在線預(yù)測(cè)工具TargetP 1.1 Server，對(duì)五加科植物SQS序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。以楤木SQS蛋白為例，預(yù)測(cè)可靠性為Ⅲ級(jí)，其葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶位肽、分泌途徑信號(hào)肽及其他的分值分別為0.065、0.237、0.061、0.743，并且不存在導(dǎo)肽分裂位點(diǎn)。因此，無法確定楤木SQS是否具有導(dǎo)肽。其他11種五加科植物的SQS預(yù)測(cè)分析結(jié)果與楤木完全一致。但P. sokpayensis的SQS蛋白預(yù)測(cè)可靠性為Ⅳ級(jí)，可能含有較低相似度的分泌途徑信號(hào)肽，但不存在導(dǎo)肽分裂位點(diǎn)。

2.3.4 跨膜結(jié)構(gòu)域特征 跨膜結(jié)構(gòu)域一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α螺旋，常由跨膜蛋白的效應(yīng)區(qū)域展現(xiàn)[14]。利用在線工具TMHMM Server v.2.0對(duì)13種五加科植物SQS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)可知，SQS蛋白均具有跨膜結(jié)構(gòu)域，P. sokpayensis有1個(gè)，其余五加科植物均有2個(gè)。跨膜區(qū)域位于C端的疏水序列，用于錨定在生物膜上。

2.3.5 亞細(xì)胞定位特征 蛋白質(zhì)在細(xì)胞中合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器發(fā)揮作用，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析及預(yù)測(cè)能極大地加速蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究[15]。采用PSORT Prediction在線工具對(duì)13種五加科植物的SQS進(jìn)行亞細(xì)胞定位。由表3可知，P. sokpayensis SQS位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的可能性為0.850，其余植物SQS位于質(zhì)膜上的可能性均大于0.640。因此判斷SQS P. sokpayensis定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其余植物SQS定位于質(zhì)膜上。

2.4 五加科植物SQS二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象），它們是構(gòu)成蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的基本要素。利用SOPMA對(duì)13種五加科植物SQS二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，五加科SQS中均有α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β折疊。以楤木SQS為例，由表4可知，其主要結(jié)構(gòu)元件是α螺旋（68.36%）、β折疊（5.31%）、無規(guī)則卷曲（20.05%）和延伸鏈（6.28%）。其余蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件與比例與楤木SQS基本一致。

2.5 蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中介于二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一種結(jié)構(gòu)層次，是指蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)中明顯分開的緊密球狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)的獨(dú)立折疊單元，具有特定的生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)域通常也是蛋白質(zhì)的功能域[16]。采用NCBI在線軟件Conserved domains對(duì)楤木SQS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行保守區(qū)和功能域的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，楤木SQS蛋白保守區(qū)域包括底物結(jié)合區(qū)、鎂離子結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)殘基蓋、催化殘基和2個(gè)天冬氨酸富集區(qū)，具有典型的多聚異戊二烯基合成酶活性結(jié)構(gòu)域和鯊烯/八氫番茄紅素合成酶活性結(jié)構(gòu)域，屬于Isoprenoid-Biosyn-C1超家族（圖3）。其余SQS蛋白均存在上述結(jié)構(gòu)域，為類異戊二烯生物合成酶。

x2.6 五加科植物SQS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤繞、折疊形成的天然構(gòu)象，主要依靠氨基酸側(cè)鏈之間的疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵、范德華力和靜電作用維持。蛋白質(zhì)的功能與其三級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析，有助于理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性[17]。利用同源建模工具 SWISS-MODEL對(duì)楤木SQS蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)

測(cè)和分析，找到模板蛋白（ACCESSION：3wef.2.A;Sequence Identity：47.73%;GMQE：0.63），再用Swiss Pdb-Viewer工具顯示楤木SQS結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，楤木SQS為單體蛋白結(jié)構(gòu)，活性中心主要由幾個(gè)α螺旋圍繞形成1個(gè)穴狀活性中心結(jié)構(gòu)，其20個(gè)磷酸化位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面。主要結(jié)構(gòu)單元為螺旋結(jié)構(gòu)，伴有折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)（圖4），與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.7 SQS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

來源于同一祖先的不同植物在進(jìn)化過程中的關(guān)系可以通過進(jìn)化樹來描述，通過構(gòu)建植物進(jìn)化樹，可以了解一種植物在進(jìn)化過程中的地位[18]。用MEGA 7.0軟件對(duì)包括五加科在內(nèi)的28種有代表性的SQS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，來源于裸子植物、被子植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌的SQS按照不同類群分為5群，在進(jìn)化遺傳學(xué)上親緣越近的物種，在SQS的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹上距離越近（圖5）?；诎被嵝蛄兄亟ǖ南到y(tǒng)進(jìn)化樹，雖不能完全客觀地反映出植物系統(tǒng)分類學(xué)關(guān)系和漫長歷史長河中的自然演化進(jìn)程，但其結(jié)果對(duì)判斷不同植物之間的親緣關(guān)系仍具有一定的借鑒意義[19]。

3 結(jié)論與討論

植物萜類化合物的生物合成途徑包括2種：一種是甲戊二羥酸（MVA）途徑，也稱細(xì)胞質(zhì)途徑，主要合成倍半萜、三萜和甾醇等化合物;一種是脫氧木酮糖磷酸酯（DXP）途經(jīng)，又稱質(zhì)體途徑，主要合成單萜、二萜、類胡蘿卜素等化合物[20-21]。雖然2種途徑在細(xì)胞的不同區(qū)域獨(dú)立進(jìn)行，但許多證據(jù)表明2種途徑有著密切的聯(lián)系，細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體之間存在某些中間產(chǎn)物交換現(xiàn)象。由于SQS競(jìng)爭利用FPP來合成三萜及甾醇，會(huì)影響單萜、二萜類物質(zhì)的合成[22]，因此SQS含量和活性決定了相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)量。

蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，SQS蛋白為酸性的親水性蛋白，部分不穩(wěn)定，部分穩(wěn)定，具有明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，不具有信號(hào)肽，可推測(cè)SQS不是分泌性蛋白，這與其屬于細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑關(guān)鍵酶相一致;都具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，無法確定是否具有導(dǎo)肽，也未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)肽的分裂位點(diǎn);亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明其可能定位在質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體上。SQS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分布于整個(gè)肽鏈結(jié)構(gòu)中。所有五加科SQS蛋白氨基酸序列中都含有多聚異戊二烯基合成酶的活性結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，屬于Isoprenoid-Biosyn-C1超家族，為類異戊二烯生物合成酶。

利用生物信息學(xué)的方法對(duì)五加科植物SQS氨基酸序列的生理生化特性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，可以為SQS蛋白及其編碼基因的克隆提供可靠的依據(jù);對(duì)其序列結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析，可為其蛋白表達(dá)與修飾提供指導(dǎo);并為更多物種SQS蛋白及其編碼基因的克隆提供可靠的依據(jù)。對(duì)其二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析有利于深入探討該酶結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系、作用機(jī)制和代謝過程。

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