陸地棉脂肪酸去飽和酶基因GhFAD2-1的克隆與表達(dá)分析

文鳳 孫亮 劉峰

摘要：Δ12-脂肪酸去飽和酶基因FAD2-1是控制種子中單不飽和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）向多不飽和脂肪酸亞油酸（C18 ∶ 2）轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平?jīng)Q定植物油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與氧化穩(wěn)定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代謝基因工程技術(shù)對(duì)棉仁中脂肪酸成分進(jìn)行定向修飾和改造。采用同源克隆技術(shù)獲得棉花品種新陸早33號(hào)的GhFAD2-1基因，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng) 1 158 bp，共編碼385個(gè)氨基酸;生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GhFAD2-1基因序列具有1個(gè)典型的FAD2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)FAD2-N端結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列與橄欖、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性較高，在75%～78%之間。利用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GhFAD2-1基因的表達(dá)量隨著棉籽的發(fā)育呈先升高后降低的趨勢(shì)，開花后40 d達(dá)到其表達(dá)峰值。使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測(cè)定其脂肪酸組成，結(jié)果表明，開花后0～40 d，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量與GhFAD2-1基因表達(dá)量變化趨勢(shì)相反。

關(guān)鍵詞：棉花;GhFAD2-1;脂肪酸;qRT-PCR;GC-MS

中圖分類號(hào)：Q785;S562.01?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0074-05

棉花是世界上最重要的纖維作物，同時(shí)也是重要的油料作物。棉籽脫殼后的棉仁中油脂含量為25%～39%[1]，是世界上次于棕櫚、大豆、油菜、油葵、花生的第六大植物油來源。2016年我國(guó)棉籽產(chǎn)量約為677.59萬t，棉籽油的產(chǎn)量約為110.00萬t，是我國(guó)主要食用植物油之一。

單不飽和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）和多不飽和脂肪酸亞油酸（C18 ∶ 2）是植物油中的主要脂肪酸組分，這2種脂肪酸組分含量在油料作物種子中的相對(duì)比例決定了食用油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與氧化穩(wěn)定性[2]。多不飽和脂肪酸亞油酸在貯藏過程中易氧化變質(zhì)，且多不飽和脂肪酸通過氫化作用可產(chǎn)生反式脂肪酸及其異構(gòu)體。反式脂肪酸會(huì)刺激身體合成膽固醇，過多的膽固醇高于細(xì)胞代謝所需，導(dǎo)致膽固醇集聚在血管中，易引發(fā)心血管疾病[3]。單不飽和脂肪酸能降低對(duì)人體健康有害的低密度膽固醇（LDL）水平，且其穩(wěn)定性較高，富含 C18 ∶ 1 的食用植物油可較長(zhǎng)時(shí)間地保存，在高溫烹調(diào)時(shí)不易氧化變質(zhì)[4]。因此，提高油酸的相對(duì)含量，增加食用植物油脂中油酸含量與亞油酸含量的比值，是油料作物品質(zhì)改良的重要內(nèi)容[5-8]。

在植物脂肪酸合成代謝過程中，Δ12-脂肪酸去飽和酶FAD2是催化油酸脫氫生成亞油酸的關(guān)鍵酶，其編碼基因FAD2的表達(dá)水平直接調(diào)控了植物中油酸與亞油酸的相對(duì)含量與比例[9]。目前FAD2基因已從大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、棉花（Gossypium hirsutum）、油葵（Helianthus annuus）、油菜（Brassica napus）和橄欖（Olea europaea）等多種植物中分離得到[10-15]。然而，目前關(guān)于棉花、大豆、油菜、花生等作物種子特異表達(dá)FAD2-1基因的調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道。研究種子FAD2-1基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控模式以及脂肪酸組分形成的生理學(xué)機(jī)制，是有效定向調(diào)控種子中油酸組分含量的前提。本研究于2016—2017年在石河子大學(xué)棉花研究所和綠洲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)，以新疆石河子棉區(qū)栽培種新陸早33號(hào)為材料，克隆其種子脂肪酸去飽和酶基因GhFAD2-1，并對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行序列分析;利用qRT-PCR檢測(cè)GhFAD2-1在種子發(fā)育過程中的表達(dá)情況;同時(shí)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析種子發(fā)育過程中的脂肪酸組分，以期為進(jìn)一步研究GhFAD2-1基因的調(diào)控機(jī)制、改良棉籽油的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株、質(zhì)粒及主要試劑

陸地棉（Gossypium hirsutum）品種新陸早33號(hào)、大腸桿菌菌株Escherichia coli XL1-Blue均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）、植物總RNA提取試劑盒（DP437，離心柱型）等購自天根生化科技（北京）有限公司。第1鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit）、克隆載體 pGEM-T easy vector和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）。

1.2 GhFAD2-1基因的克隆

取新陸早33號(hào)花后35 d的棉花種子，去除外層軟殼后，將棉仁在研缽中用液氮冷激后快速研磨，將粉末快速裝入RNase-free的離心管中，保證樣品不溶解，并讓液氮揮發(fā)，采用植物總RNA提取試劑盒（DP437，離心柱型）提取總RNA，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用已知的FAD2-1基因序列信息（GenBank：HQ259410.1），設(shè)計(jì)特異性引物，上游：5′-ATGGGTGCCGGTGGTAGGA-3′，下游：5′-TTAGAACTTGTTACGATACC-3′。特異性引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄總RNA獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。目標(biāo)條帶回收步驟按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）的說明書進(jìn)行。利用克隆載體連接試劑盒將回收片段連接到pGEM-T easy vector上，獲得pGEM-T-FAD2-1。轉(zhuǎn)化E.coli XL1-Blue，篩選抗氨芐青霉素的菌落，并進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序。