戴 青，韓寧寧，趙 暉，楊秀玉

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

氯唑西林為半合成青霉素，耐酸耐青霉素酶，主要對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的殺菌作用，能有效治療部分革蘭陰性菌、葡萄球菌和鏈球菌引起的感染。芐星氯唑西林是氯唑西林的二芐基乙二胺鹽，其制劑主要為芐星氯唑西林乳房注入劑，在獸醫(yī)應(yīng)用上主要用于治療敏感菌引起的奶牛干乳期乳房炎［1-2］。芐星氯唑西林以氯唑西林為主要活性成分，經(jīng)國(guó)家獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)數(shù)據(jù)查詢系統(tǒng)［3］查詢，我國(guó)獸藥生產(chǎn)企業(yè)中目前持有生產(chǎn)文號(hào)的芐星氯唑西林乳房注入劑生產(chǎn)企業(yè)有16家?！吨袊?guó)獸藥典》2015年版一部收載了芐星氯唑西林與芐星氯唑西林乳房注入劑［4］。

《中國(guó)獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及到含量測(cè)定所需的氯唑西林對(duì)照品、二芐基乙二胺對(duì)照品和鑒別所需的芐星氯唑西林對(duì)照品三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前氯唑西林和二芐基乙二胺含量測(cè)定可溯源至中國(guó)食品藥品檢定研究院的對(duì)照品，而紅外鑒別所需的芐星氯唑西林對(duì)照品僅USP有供應(yīng)，但國(guó)外對(duì)照品價(jià)格昂貴，購(gòu)買周期長(zhǎng)。因此，擬研制芐星氯唑西林對(duì)照品，用于芐星氯唑西林及其制劑的紅外鑒別，對(duì)于獸藥生產(chǎn)企業(yè)芐星氯唑西林及制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀（Empower 3色譜工作站）；Waters 996二極管陣列檢測(cè)器（PDA），Mettler Toledo XS205 電子分析天平（精度0.01mg）；Nicolet FT-550 傅立葉紅外光度計(jì)；Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分測(cè)定儀；HANNA Instruments HI9017酸度計(jì)。

1.2 試藥 芐星氯唑西林原料藥由鄲城巨鑫生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：201709001；氯唑西林對(duì)照品（批號(hào)：130423-200903，含量 91.0%）、二芐基乙二胺對(duì)照品（批號(hào)：130638-201301，含量99.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；芐星氯唑西林USP對(duì)照品批號(hào)：G1M102；乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相鑒別 采用2.6.1 與 2.6.2 項(xiàng)下的高效液相色譜條件，分別取兩項(xiàng)下的供試品溶液與對(duì)照品溶液進(jìn)樣，采集色譜圖，考察供試品溶液主峰與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間是否一致，紫外光譜圖是否一致。結(jié)果見圖1～圖4，在氯唑西林含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜圖中，芐星氯唑西林原料主峰與氯唑西林對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，且純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，二者紫外光譜圖匹配角度小于匹配閾值，可判定為相同物質(zhì)；在二芐基乙二胺含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜圖中，芐星氯唑西林原料主峰與二芐基乙二胺對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，且純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰，在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，二者紫外光譜圖匹配角度小于匹配閾值，可判定為相同物質(zhì)。

圖1 氯唑西林對(duì)照品光譜指數(shù)圖Fig 1 The HPLC spectrum of cloxacillin reference

圖2 芐星氯唑西林原料氯唑西林光譜指數(shù)圖Fig 2 The HPLC spectrum of cloxacillin in benzathine cloxacillin raw material

圖3 二芐基乙二胺對(duì)照品光譜指數(shù)圖Fig 3 The HPLC spectrum of dibenzylethylenediamine reference

2.2 紅外光譜鑒別 采用溴化鉀壓片法進(jìn)行測(cè)定，采集4000～400 cm-1波段紅外光譜圖，考察芐星氯唑西林原料與芐星氯唑西林USP對(duì)照品的紅外光吸收?qǐng)D譜是否一致。結(jié)果見圖5～圖6，芐星氯唑西林原料的紅外光吸收?qǐng)D譜與USP對(duì)照品的圖譜一致。

2.3 酸度測(cè)定 取芐星氯唑西林原料0.1 g，加水10 mL制成懸浮液，用苯二甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器后測(cè)定pH值。結(jié)果測(cè)得pH 值為 5.1。

圖4 芐星氯唑西林原料二芐基乙二胺光譜指數(shù)圖Fig 4 The HPLC spectrum of dibenzylethylenediamine in benzathine cloxacillin raw material

圖5 芐星氯唑西林USP對(duì)照品紅外光譜圖Fig 5 The IR spectrum of benzathine cloxacillin USP reference

2.4 水分測(cè)定 取芐星氯唑西林原料，用卡爾·費(fèi)休法測(cè)定其水分含量。結(jié)果測(cè)得水分為3.6%。

2.5 含量均勻性評(píng)價(jià) 采用2.6.1項(xiàng)下的高效液相色譜條件及測(cè)定法對(duì)本批芐星氯唑西林原料進(jìn)行了氯唑西林含量均勻性測(cè)試，并采用單因子方差分析法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。將樣品等分成10份，每份取樣2次進(jìn)行測(cè)定，樣品間自由度為9，樣品內(nèi)自由度為10，在約定的自由度水平α＝0.05的顯著水平下，計(jì)算臨界值 F0.05（9、10），計(jì)算結(jié)果與查表得到的 F 臨界值 F0.05（9、10） ＝3.02 比較，若計(jì)算值小于3.02，則表明在α＝0.05的顯著水平下，樣品含量是均勻的。結(jié)果見表1～表2，其統(tǒng)計(jì)量F為2.00，小于 3.02，表明本批原料均勻性良好，符合國(guó)家對(duì)照品研制的要求。

圖6 芐星氯唑西林原料紅外光譜圖Fig 6 The IR spectrum of benzathine cloxacillin raw material

表1 芐星氯唑西林原料氯唑西林含量均勻性結(jié)果Tab 1 The content homogeneity results of cloxacillin

表2 芐星氯唑西林原料均勻性的單因素方差分析結(jié)果Tab 2 Result of one-way analysis of variance for content homogeneity

2.6 含量測(cè)定 《獸藥標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品、對(duì)照藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［5］中關(guān)于化學(xué)對(duì)照品的基本技術(shù)要求中規(guī)定供檢查用的對(duì)照品原料，一般純度不低于90.0%。而《中國(guó)獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及到氯唑西林和二芐基乙二胺兩種物質(zhì)的測(cè)定，采用的是兩種液相色譜條件，目前沒有建立用同一色譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定這兩種物質(zhì)的方法，也無(wú)其有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)研究方法，因此擬分別采用氯唑西林和二芐基乙二胺的含量測(cè)定液相色譜條件對(duì)原料進(jìn)行測(cè)定，確認(rèn)二者符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定即認(rèn)為該原料符合使用要求。

2.6.1 氯唑西林

2.6.1.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以 0.1 mol／L磷酸二氫鈉溶液 -乙腈（3∶1），用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至4.6±0.2為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫40℃。

2.6.1.2 測(cè)定法 取本品適量，精密稱定，加稀釋液（取磷酸二氫鈉3.15 g，加水450 mL使溶解，加乙腈300 mL混勻，用磷酸或1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4）溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含氯唑西林0.1 mg的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氯唑西林對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中氯唑西林的含量。

2.6.1.3 結(jié)果 兩名檢驗(yàn)員各進(jìn)樣5份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次。取兩人的合并計(jì)算值，結(jié)果見表3，色譜圖見圖1～圖2。

表3 芐星氯唑西林原料氯唑西林含量測(cè)定結(jié)果Tab 3 The content determination results of cloxacillin

二者加權(quán)平均值為69.45%，按無(wú)水物計(jì)算，氯唑西林含量為72.1%。

2.6.2 二芐基乙二胺

2.6.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（端基封尾）；以0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.1）-乙腈（87∶13）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.6.2.2 測(cè)定法 取本品約 0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加稀釋液（取磷酸二氫鈉3.15 g，加水450 mL使溶解，加乙腈300 mL混勻，用磷酸或1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4）適量，超聲溶解，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖；另取二芐基乙二胺對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中二芐基乙二胺的含量。

2.6.2.3 結(jié)果 由一人進(jìn)行測(cè)定，樣品平行制備2份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，以4次的平均值作為測(cè)定值，結(jié)果見表4，色譜圖見圖3～圖4。

表4 芐星氯唑西林原料二芐基乙二胺含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 The content determination results of dibenzylethylenediamine

按無(wú)水物計(jì)算，二芐基乙二胺含量為20.0%。

綜上結(jié)果，按無(wú)水物計(jì)算，氯唑西林含量為72.1%，二芐基乙二胺含量為20.0%，二者含量之和為92.1%，符合《中國(guó)獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

3.1 質(zhì)量控制 由于《中國(guó)獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用的是兩種液相色譜條件分別對(duì)其中的氯唑西林和二芐基乙二胺進(jìn)行含量測(cè)定，并分別報(bào)告二者的含量，目前沒有建立用同一色譜系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定這兩種物質(zhì)的方法，也無(wú)其有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)研究方法，因此本研究中以二者的含量作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究建立的芐星氯唑西林國(guó)家對(duì)照品主要供芐星氯唑西林及其制劑紅外鑒別用，而要想獲得優(yōu)質(zhì)的紅外光譜，需除去樣品中的水分［6］，因此在考察本對(duì)照品原料是否符合要求時(shí)均按照無(wú)水物來計(jì)算。

3.2 穩(wěn)定性監(jiān)測(cè) 藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重要的基本性質(zhì)之一，用來描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時(shí)間變化情況，對(duì)照品使用中需要特別注意穩(wěn)定性問題。長(zhǎng)期穩(wěn)定性是在規(guī)定的貯存條件下，在較長(zhǎng)周期內(nèi)定期地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性評(píng)估，考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力［7-8］。根據(jù)獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范要求，今后將對(duì)芐星氯唑西林對(duì)照品進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，第一次考察時(shí)間為一年后，以后每年定期測(cè)定一次。原則上對(duì)氯唑西林及二芐基乙二胺含量進(jìn)行考察，由一人進(jìn)行測(cè)定，每次測(cè)定平行樣不少于兩份，按無(wú)水物計(jì)算，氯唑西林與二芐基乙二胺含量應(yīng)符合規(guī)定。