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      檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制

      2019-08-26 02:38:28朱亮亮王琳琛王兆芹崔海峰張坤馮才偉萬(wàn)宇平
      山東畜牧獸醫(yī) 2019年8期
      關(guān)鍵詞:半抗原膠體金層析

      朱亮亮 王琳琛 王兆芹 崔海峰 張坤 馮才偉 萬(wàn)宇平*

      檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制

      朱亮亮①③王琳?、佗弁跽浊邰诖藓7澧佗蹚埨あ佗垴T才偉①③萬(wàn)宇平*①③

      (①北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 102206 ②北京望爾生物技術(shù)有限公司 北京 ③北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心)

      本文通過(guò)制備有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原,研制出一種能夠檢測(cè)蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析試紙條,辛硫磷、對(duì)硫磷、丙溴磷、氯唑磷等有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)限均為200μg/kg,檢測(cè)時(shí)間僅為15min,假陽(yáng)性率和假陰性率均為0,符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求,試紙條能夠應(yīng)用到基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè),具有實(shí)際意義。

      有機(jī)磷農(nóng)藥 膠體金免疫層析試紙條 快速檢測(cè)

      有機(jī)磷農(nóng)藥是一種含有磷元素的有機(jī)化合物農(nóng)藥,它種類多,藥性強(qiáng),農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常常用作殺蟲(chóng)劑。然而,不科學(xué)地使用農(nóng)藥導(dǎo)致了蔬菜瓜果的農(nóng)藥殘留超標(biāo),威脅到人類的健康,嚴(yán)重地還會(huì)對(duì)人的臟器、生殖系統(tǒng)等造成損壞,影響代謝功能[1-3]。因此,我國(guó)規(guī)定了食品中農(nóng)藥殘留限量要求。農(nóng)業(yè)部、國(guó)家衛(wèi)計(jì)委、食監(jiān)局聯(lián)合發(fā)布2016年第16號(hào)公告《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB2763-2016)等107項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),公布了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)所涉及的食品中農(nóng)藥產(chǎn)品殘留量的檢測(cè)方法。

      目前,檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的多為儀器方法,比如氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-14]。儀器方法較難應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè),因此本文介紹的有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條較好地解決了該問(wèn)題。該試紙條能夠檢測(cè)蔬菜、水果中的有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)殘留,靈敏度較高、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)方便,是理想的初篩方法,并具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,氯金酸(HAuCl4·3H2O)、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,檸檬酸三鈉、碳酸鉀購(gòu)自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;渦旋儀、均質(zhì)器均購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原的制備 (1)取化合物a 1.0g,加甲醇30ml溶解,取鹽酸羥胺0.27g,加水1ml溶解,加入到甲醇溶液中,加碳酸鉀0.46g,加熱回流24h,停止反應(yīng),冷卻到室溫,得到A液;取鋅粉0.31g,加水5ml,攪拌,加冰乙酸0.2ml,90℃攪拌30min,加入全部的A液,繼續(xù)攪拌4h,停止反應(yīng),加水100ml,乙酸乙酯70ml×3,萃取三次,合并有機(jī)相,蒸干,乙酸乙酯/正己烷(v/v,1/10)120ml重結(jié)晶,得到化合物b0.81g,收率81%;(2)取化合物b 0.81g,加氫溴酸50ml溶解,100℃回流反應(yīng)3h,停止反應(yīng),加6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到7,加乙酸乙酯100ml×3,萃取三次,合并有機(jī)相,蒸干,上硅膠柱,乙酸乙酯/石油醚(v/v,1/5)洗脫,得到化合物c 0.7g,收率92.1%;(3)取化合物c 0.7g,加甲醇30mL溶解,加二乙氧基-氯硫磷0.55g,加KOH 0.78g,55℃反應(yīng)5h,停止反應(yīng),加水,加6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到6,加二氯甲烷120ml×3,萃取三次,合并有機(jī)相,蒸干,無(wú)水乙醇/乙腈(v/v,1/1)60ml重結(jié)晶,得到化合物d 1.3g,收率86.67%,即為半抗原產(chǎn)物。

      圖1 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原合成

      1.2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物合成 取化合物d半抗原產(chǎn)物38mg,加DMF 2ml溶解,加N-琥珀酰亞胺17mg,加EDC 29mg,室溫?cái)嚢?h,得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白100mg,加0.05mol/L CB緩沖液溶解,得到B液,將A液滴加到B液中,4℃攪拌24h,0.02mol/L PB緩沖液透析純化3d,每天換液3次,得到有機(jī)磷-BSA免疫原,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.3 有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備 在磁力攪拌下,用0.2mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2,每毫升膠體金溶液中加入70μg有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體,混勻,靜置10min,加入10% BSA,使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%,靜置10min。離心、洗滌、重懸,置4℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.4 將有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上 將100μl有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔試劑微孔板中,置于冷凍干燥機(jī),冷阱溫度為-50℃,預(yù)凍3h,再真空干燥15h,即得到有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑。

      1.2.5 檢測(cè)方法 向微孔中加入100ml待檢樣本溶液,混勻,室溫下孵育3min,吸取70ul滴至試紙條上,反應(yīng)10min,根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果。其它時(shí)間判讀無(wú)效。

      圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

      1.2.6 樣本檢測(cè)限 在空白白菜、蘋果樣本中分別添加有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、辛硫磷、丙溴磷、氯唑磷)標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、100、150、200、250、300μg/L,用三批試紙條進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)5次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限。

      1.2.7 試紙條的特異性 分別配制500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物,用此試紙條檢測(cè),重復(fù)3次,判斷試紙條的特異性。

      1.2.8 準(zhǔn)確性 農(nóng)業(yè)部文件要求:以假陽(yáng)性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取50份空白白菜、蘋果樣品,分別添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度至200μg/kg,用該試紙條進(jìn)行檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥藥物殘留,計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率?!掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定:試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%,假陰性率應(yīng)為零。

      1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性 將試紙條保存于2~8℃環(huán)境中,每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性,連續(xù)測(cè)定15個(gè)月。具體方法為:分別檢測(cè)20份空白白菜、蘋果樣品,添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度至200μg/kg,重復(fù)測(cè)定2次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 樣本檢測(cè)限

      配置有機(jī)磷農(nóng)藥濃度分別為0、100、150、200、250、300μg/L的蔬菜、水果樣品,按照1.2.6步驟進(jìn)行檢測(cè),確定檢測(cè)限。該試紙條的檢測(cè)限為200μg/kg,見(jiàn)表1。

      表1 有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限 (μg/L)

      注:- 表示陰性,+ 表示陽(yáng)性。

      2.2 特異性

      該試紙條檢測(cè)500μg/L的克百威、呋喃丹和敵敵畏等藥物,結(jié)果均呈陰性,表明該試紙條特異性較好。

      2.3 準(zhǔn)確性

      用試紙條檢測(cè)50份空白蔬菜、水果樣品,檢測(cè)結(jié)果均為陰性,說(shuō)明假陽(yáng)性率低于5%;添加有機(jī)磷農(nóng)藥質(zhì)量濃度為200μg/kg的50份陽(yáng)性蔬菜、水果樣品,試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,說(shuō)明試紙條假陰性率為零,符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

      2.4 穩(wěn)定性

      12個(gè)月內(nèi),試紙條的假陽(yáng)性率和假陰性率均符合要求,從第13個(gè)月起,試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象。

      3 討論

      目前,利用儀器方法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的文獻(xiàn)較多,但是利用膠體金免疫層析試紙條能夠同時(shí)檢測(cè)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的文獻(xiàn)較少。劉瑩在《有機(jī)磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制》一文記錄了能夠檢測(cè)9種有機(jī)磷農(nóng)藥(殺螟硫磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷、甲拌磷、毒死蜱、三唑磷、喹硫磷、倍硫磷)殘留的試紙條檢測(cè)方法,檢測(cè)限在250~1500μg/kg[15]。丁國(guó)興等人在《酶促反應(yīng)試紙條快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥》一文中記錄了用酶促反應(yīng)試紙條檢測(cè)敵敵畏、甲基對(duì)硫磷、滅多威、異丙威、涕滅威等6種有機(jī)磷農(nóng)藥的技術(shù)方法,靈敏度為2000μg/kg[16]。王菡等人在《膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留》一文中記錄了檢測(cè)毒死蜱的膠體金技術(shù),檢測(cè)限為4000μg/kg[17]。經(jīng)過(guò)查閱有機(jī)磷快速檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn),尚未發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)檢測(cè)辛硫磷、對(duì)硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4種有機(jī)磷農(nóng)藥,并且檢測(cè)限為200μg/kg的文獻(xiàn)。

      本文通過(guò)制備有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原,讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原,最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求,對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試,均符合要求。試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15min,比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短,操作更簡(jiǎn)便。試紙條檢測(cè)限為200μg/kg,未見(jiàn)免疫方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

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      (2019–05–23)

      典型性農(nóng)殘多靶標(biāo)高效快速檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用(Z181100009318006)項(xiàng)目資助

      S859.79+7

      A

      1007-1733(2019)08-0010-03

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