雞線粒體ND1基因變異/異質(zhì)性及其與性狀的關(guān)聯(lián)分析

徐媛媛，侯玲靈，姬杰菲，王煥杰，李思露，陳文，康相濤，黃艷群

雞線粒體ND1基因變異/異質(zhì)性及其與性狀的關(guān)聯(lián)分析

徐媛媛1，侯玲靈2，姬杰菲1，王煥杰1，李思露1，陳文1，康相濤1，黃艷群1

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2許昌市畜牧局（市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所），河南許昌 461099）

【】探究雞線粒體ND1基因的異質(zhì)性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行線粒體異質(zhì)性在不同品種間和固始雞資源群中的分布研究及其對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀的效應(yīng)分析?！尽窟x用固始雞、盧氏雞、來(lái)航雞、白洛克雞、白羽絲毛烏骨雞、藏雞、肉雞以及河南斗雞8種各具特色雞種的血樣DNA，利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行mt.A4589G變異/異質(zhì)性在自然群體的分布研究。此外，利用實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的固始雞資源群的血樣DNA，通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行mt.A4589G變異/異質(zhì)性在固始雞資源群的分布研究及其與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析，包括腹脂、腿肌率、盲腸長(zhǎng)度等屠體性狀指標(biāo)，脛長(zhǎng)、胸深、體斜長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀指標(biāo)，肌纖維直徑、肌肉pH、剪切力等肉質(zhì)性狀指標(biāo)以及葡萄糖、淀粉酶、甘油三酯等血液生化指標(biāo)，進(jìn)而掌握雞線粒體ND1基因異質(zhì)性及其潛在效應(yīng)?！尽浚?）在8個(gè)雞品種中，從線粒體ND1基因全長(zhǎng)檢測(cè)到一個(gè)同義突變mt.A4589G，其分布具有明顯的品種特性：外來(lái)品種如肉雞、白洛克和白來(lái)航雞的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，而國(guó)內(nèi)地方品種如絲羽烏骨雞、河南斗雞、盧氏雞、固始雞和藏雞均為G；（2）通過(guò)PCR-RFLP檢測(cè)到mt.A4589G在不同品種以及固始雞資源群中皆存在異質(zhì)性。在8個(gè)不同品種中，僅從固始雞、河南斗雞和肉雞中檢測(cè)到5個(gè)AG異質(zhì)性個(gè)體，異質(zhì)性發(fā)生的頻率為0.063，表明mt.A4589G異質(zhì)性的分布具有一定的品種特性。而在固始雞資源群中，mt.A4589G存在較不同品種間更為廣泛的異質(zhì)性，在F0、F1和F2代的異質(zhì)性發(fā)生頻率分別為0.81、0.41和0.70，表明mt.A4589G異質(zhì)性具有普遍性；（3）mt.A4589G異質(zhì)性與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析表明，mt.A4589G異質(zhì)性對(duì)腹脂、皮脂厚度、8周脛長(zhǎng)、腿肌纖維直徑、葡萄糖和乳酸脫氫酶等的影響都達(dá)到差異顯著水平(＜0.05)；（4）mt.A4589G不同的異質(zhì)性等級(jí)與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析表明，mt.A4589G異質(zhì)性等級(jí)除與腹脂、腹脂率和腿肌率等屠體性狀顯著相關(guān)（＜0.05）外，還與生長(zhǎng)性狀（8周脛長(zhǎng)等）、血清生化指標(biāo)（葡萄糖等）均產(chǎn)生顯著的關(guān)聯(lián)（＜0.05）?！尽縨t.A4589G是一個(gè)異質(zhì)性變異，其異質(zhì)性的分布具有明顯的品種特性，在自然群體的異質(zhì)性發(fā)生頻率較低，而mt.A4589G在固始雞資源群中存在廣泛的異質(zhì)性。通過(guò)mt.A4589G異質(zhì)性及其不同異質(zhì)性等級(jí)與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，mt.A4589G變異/異質(zhì)性與雞的腹脂、血液中葡萄糖水平等性狀均產(chǎn)生了顯著的關(guān)聯(lián)（＜0.05）。

雞；ND1基因；PCR-RFLP；異質(zhì)性；關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，有關(guān)線粒體異質(zhì)性的研究成為一大熱點(diǎn)，主要集中在人類線粒體疾病的研究上。而雞作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，關(guān)于其線粒體異質(zhì)性的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)研究雞線粒體ND1基因（mtND1）的異質(zhì)性在品種的分布及其與固始雞資源群重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，探究線粒體ND1基因異質(zhì)性的品種分布特性及其潛在的效應(yīng)。【前人研究進(jìn)展】線粒體是機(jī)體細(xì)胞必需的細(xì)胞器，在許多關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡等[1]，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化代謝釋放能量的場(chǎng)所[2]。NADH脫氫酶（NADH dehydrogenase）是呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的主要組成，在呼吸鏈中直接參與氫與電子傳遞并通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，參與能量代謝。同時(shí)，NADH脫氫酶是三羧酸循環(huán)中較為重要的一種酶，對(duì)于線粒體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)有一定的作用[3]。其中，NADH脫氫酶亞單位1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）基因位于線粒體DNA（mtDNA）上，mtDNA為一環(huán)狀分子[4]，含有37個(gè)基因[5]。單個(gè)細(xì)胞可以包含數(shù)百至數(shù)千個(gè)mtDNA拷貝[5]，由于遺傳或體細(xì)胞突變，這些mtDNA可能彼此不同。這種單個(gè)細(xì)胞內(nèi)或同一個(gè)體不同細(xì)胞間存在兩種或兩種以上mtDNA變異體的現(xiàn)象稱為線粒體異質(zhì)性[6-7]。一般情況下，mtDNA的突變能夠改變電子傳遞組分，導(dǎo)致過(guò)氧化酶自由基以及氧化應(yīng)激的增加[8]。許多研究表明，線粒體基因的突變是引起人類多種遺傳性疾病、退行性疾病及衰老[9]的重要原因之一，其中，這些突變常以異質(zhì)性狀態(tài)存在，即突變型和野生型基因組同時(shí)存在于同一細(xì)胞中。當(dāng)突變線粒體DNA（異質(zhì)性水平）比例較高，即線粒體異質(zhì)性達(dá)到一定閾值時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致病理后果[10]。Schon等[11]認(rèn)為，與氧化磷酸化活性下降相關(guān)的體細(xì)胞mtDNA異質(zhì)性突變可能在衰老過(guò)程中起重要作用。YU等[12]表明，mtDNA異質(zhì)性變異在老年人各種組織中的頻率增加，將會(huì)導(dǎo)致呼吸能力的致病性喪失。目前，關(guān)于鳥(niǎo)類線粒體的報(bào)道主要集中在種系發(fā)生的研究上[13-16]。Komiyama等[17]通過(guò)對(duì)mtDNA的長(zhǎng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序以及單倍型分析來(lái)研究家禽的進(jìn)化。GUAN等[18]從肉用雞和蛋用雞中鑒定了線粒體基因組的113個(gè)SNPs。魯衛(wèi)衛(wèi)[19]進(jìn)行了雞線粒體ND2基因異質(zhì)性變異的研究，通過(guò)PCR測(cè)序檢測(cè)到ND2基因中的17個(gè)突變，通過(guò)CRS-PCR-RFLP方法進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)mt.A5703T和mt.T5727G變異位點(diǎn)具有異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)該異質(zhì)性變異對(duì)固始雞F2代的胸肌脂肪含量有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于雞線粒體ND1基因異質(zhì)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用PCR-RFLP技術(shù)探究雞線粒體ND1基因的異質(zhì)性，進(jìn)行線粒體ND1異質(zhì)性變異在不同雞品種間和固始雞資源群中的分布研究，并在此基礎(chǔ)上探討該變異位點(diǎn)不同異質(zhì)性程度與固始雞F2代資源群屠體性狀、生長(zhǎng)性狀、肉質(zhì)性狀和血清生化指標(biāo)的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】揭示線粒體ND1基因異質(zhì)性的品種分布特性及其潛在的效應(yīng)，為利用線粒體異質(zhì)性在雞育種中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分別選用河南家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程中心存儲(chǔ)的固始雞（10只）、盧氏雞（10只）、來(lái)航雞（10只）、白洛克雞（10只）、白羽絲毛烏骨雞（10只）、藏雞（10只）、肉雞（12只）和河南斗雞（8只）的血樣，開(kāi)展mtND1在不同品種的變異/異質(zhì)性的分布研究。

固始雞資源群的構(gòu)建和性狀測(cè)定方法，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。資源群是利用蛋肉兼用型固始雞和肉用型安卡雞純系按公、母雞1﹕6比例進(jìn)行正反雜交構(gòu)建而成。群體包含7個(gè)家系，共806只雞，其中正交系4個(gè)，反交系3個(gè)。并于84d屠宰806只F2代雞，測(cè)定屠體重、全凈膛重、半凈膛重、腹脂重、胸肌重、腿肌重、脾重、肌胃重、肝臟重、胰腺重、皮脂厚度、十二指腸長(zhǎng)度、回腸長(zhǎng)度、盲腸長(zhǎng)度等屠體性狀指標(biāo)；測(cè)定體重、脛長(zhǎng)、脛圍、胸骨長(zhǎng)、胸深、胸寬、胸角、體斜長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀指標(biāo)；測(cè)定肌纖維直徑、肌肉密度、肌肉脂肪含量、肌肉pH、剪切力、失水率等肉質(zhì)性狀指標(biāo)以及測(cè)定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、肌酐、淀粉酶、乳酸脫氫酶等血清生化指標(biāo)。利用存儲(chǔ)的固始雞資源家系F0、F1和F2代的血樣開(kāi)展mtND1的變異/異質(zhì)性在固始雞資源群不同代次的分布及其與F2代性狀的關(guān)聯(lián)研究。

血樣DNA的提取參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的酚-氯仿抽提法進(jìn)行[20]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)雞線粒體ND1基因序列（GenBank登錄號(hào)：AP003317），利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7.0，避開(kāi)相應(yīng)的線粒體假基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的Primer- BLAST以及DNAMAN軟件對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，將符合要求的引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成（表 1）。

表1 本研究所用引物

序列來(lái)源GenBank（AP003317） The sequence (GenBank accession：AP003317)

1.3 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系：1 μL dNTP Mix（10 mmol·L-1each），10 μL 10×LampTMBuffer，2 μL上游引物（10 pmol·μL-1），2μL下游引物（10 pmol·μL-1），2 μL基因組DNA模板（50 ng·μL-1），1 μL LampTMDNA Polymerase，加超純水至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃或57℃退火35 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.4 樣品測(cè)序

先對(duì)由ND1-1引物擴(kuò)增DNA混池（由來(lái)自于8個(gè)不同品種的個(gè)體等量DNA混合而成）獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。并采用引物ND1-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)由PCR-RFLP法從8個(gè)品種中檢測(cè)到的5個(gè)異質(zhì)性樣本（即AG型）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司采用Sanger法進(jìn)行。

1.5 PCR-RFLP酶切反應(yīng)

測(cè)序發(fā)現(xiàn)mtND1 基因內(nèi)的mt.A4589G變異可引起自然酶切位點(diǎn)Bsp1286 I的改變?？刹捎肞CR-RFLP進(jìn)行該變異的檢測(cè)。酶切所用引物及內(nèi)切酶信息見(jiàn)表1。酶切反應(yīng)體系（總體積20 μL）：0.3 μL內(nèi)切酶Bsp1286 I，1 μL 10×PCR Buffer，10 μL ND1-2 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，1 μL BSA，7.7 μL超純水。于37℃恒溫箱消化過(guò)夜（8—16 h）。酶切產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 基因型和異質(zhì)性比例的判定

根據(jù)凝膠電泳圖像中酶切產(chǎn)物的片段判斷基因型。用Genetools軟件分析其異質(zhì)性程度。對(duì)mt.A4589G位點(diǎn)，其異質(zhì)性程度采用mt.4589A的比例來(lái)表示。等位基因A的比例=堿基A的灰度值/（堿基A的灰度值+堿基G的灰度值）×100%，等位基因A的比例為0代表的是GG純合基因型，100%代表的是AA純合基因型。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SAS（V8版）軟件中的一般線性模型進(jìn)行異質(zhì)性變異與固始雞F2代資源群相關(guān)性狀間的關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析模型：y=μ+j+s+r+e，其中y為生產(chǎn)性能測(cè)定值，μ為生產(chǎn)性能的最小二乘均值，j為基因型對(duì)生產(chǎn)性能的效應(yīng)值，s為性別對(duì)生產(chǎn)性能的效應(yīng)值，r為家系對(duì)生產(chǎn)性能的效應(yīng)值，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。最小二乘均數(shù)的多重比較采用Bonferroni方法進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 線粒體ND1基因變異位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

首先采用ND1-1引物和構(gòu)建的DNA混合池（由8個(gè)不同雞品種血液DNA構(gòu)建）進(jìn)行線粒體ND1基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖1）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為995bp，與預(yù)期的目的片段長(zhǎng)度相符。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序顯示ND1基因全長(zhǎng)上存在一個(gè)變異位點(diǎn)mt.A4589G（根據(jù)AP003317序列命名，圖2）。經(jīng)DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，該變異是一個(gè)同義突變位點(diǎn)，但引起了Bsp1286I自然酶切位點(diǎn)的改變。

2.2 PCR-RFLP檢測(cè)mt.A4589G變異/異質(zhì)性在品種間的分布

由于mt.A4589G位點(diǎn)A→G的變異能夠引起自然酶切位點(diǎn)Bsp1286I的改變，因此采用Bsp1286I（逢堿基G被切開(kāi)）限制性酶切的方式（PCR-RFLP）對(duì)該位點(diǎn)在8個(gè)品種間的變異/異質(zhì)性情況進(jìn)行研究。利用ND1-2引物檢測(cè)mt.A4589G變異在品種間的分布，得到了預(yù)期的PCR產(chǎn)物（圖3）。

圖1 引物ND1-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

圖2 mt.ND1基因的測(cè)序(DNA混合池為模板)

圖3 ND1-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

ND1-2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為356 bp，被Bsp1286I 內(nèi)切酶切開(kāi)后片段分別為283 bp和73bp。經(jīng)過(guò)酶切分型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（表2），在8個(gè)群體中檢測(cè)到3種基因型，顯示mt.A4589G變異是一個(gè)異質(zhì)性變異。根據(jù)其堿基變異，將出現(xiàn)兩條帶（283bp和73bp）的命名為GG型，單條帶（356bp）的命名為AA型，3條帶（356、283和73bp）的命名為AG型（圖4）。分析發(fā)現(xiàn)mt.A4589G變異的分布具有明顯的品種特性：固始雞、河南斗雞、盧氏雞、絲羽烏骨雞和藏雞的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，而肉雞、來(lái)航雞和白洛克的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳（表2）。此外，8個(gè)品種中共檢測(cè)到5個(gè)異質(zhì)性個(gè)體（AG型），而其它個(gè)體皆為純合型。異質(zhì)性的發(fā)生頻率為0.063。異質(zhì)性個(gè)體分別存在于固始雞、肉雞和河南斗雞中。

圖4 PCR-RFLP檢測(cè)mt.A4589G位點(diǎn)變異

表2 線粒體mt.A4589G變異/異質(zhì)性在8個(gè)雞品種的分布

1）表格中的大寫字母分別表示不同的雞種：GS．固始雞；BC．肉雞；HC．河南斗雞；LS．盧氏雞；WL．白來(lái)航；WP．白洛克；SK．絲羽烏骨雞；TB．藏雞。2）AG代表異質(zhì)性個(gè)體的基因型

1)The capital letters in the table indicate different breeds of chicken: GS．Gushi chicken；BC．Arbor Acres broiler chicken；HC．Henan Cockfighting chicken；LS．Lushi chicken；WL．White Leghorn chicken；WP．White Plymouth Rock chicken；SK．Silkie chicken；TB．Tibetan chicken.2)AG represents the genotype of a heteroplasmic individual

利用引物ND1-2對(duì)由PCR-RFLP法從8個(gè)品種中檢測(cè)到的5個(gè)異質(zhì)性個(gè)體（AG型）進(jìn)一步進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物直接測(cè)序與PCR-RFLP的檢測(cè)呈現(xiàn)了相似的結(jié)果（圖5）。PCR-RFLP方法檢測(cè)到異質(zhì)性為45%的個(gè)體（GS1），其測(cè)序峰圖顯示堿基A和堿基G峰值等高，幾乎完全重合。而其它4個(gè)樣品在峰值圖上皆呈現(xiàn)的是主要堿基G，次要堿基A僅有一點(diǎn)點(diǎn)底峰，這可能與不同個(gè)體線粒體異質(zhì)性程度的差異有關(guān)（圖5）。

2.3 mt.A4589G變異/異質(zhì)性在固始雞資源群的分布

采用PCR-RFLP檢測(cè)mt.A4589G變異/異質(zhì)性在固始雞資源群各代次的分布。結(jié)果顯示：mt.A4589G在固始雞資源群中存在廣泛的多態(tài)，并且發(fā)現(xiàn)mt.A4589G在資源群中存在較品種間更為廣泛的異質(zhì)性，在F0、F1和F2代的異質(zhì)性發(fā)生比率分別為0.81、0.41和0.70（表3）。

本研究在固始雞F2代資源群中所涉及檢測(cè)到的樣本共有771個(gè)，其中66個(gè)為AA型，540個(gè)為AG型，165個(gè)為GG型，則AA型、AG型和GG型對(duì)應(yīng)的頻率分別為0.09、0.70和0.21（表3）。AA型在F2代資源群體中的比例低。

2.4 mt.A4589G異質(zhì)性與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析

由于AA型在F2代資源群體中的比例低，mt.A4589G變異位點(diǎn)的不同基因型在F2代不同家系群體中的分布差異較大，大部分家系只有兩種基因型。因此，為保證統(tǒng)計(jì)分析的準(zhǔn)確性，本研究根據(jù)基因型在家系的分布特點(diǎn)，分別對(duì)包含AA 型和 AG 型以及AG 型和GG 型的家系進(jìn)行mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞F2代資源群性狀的關(guān)聯(lián)分析。

1）左側(cè)是利用PCR-RFLP法檢測(cè)到的5個(gè)異質(zhì)性個(gè)體的品種及異質(zhì)性程度，右側(cè)是通過(guò)對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證得到的峰圖（GS1、GS2—固始雞，BC1—肉雞，HC1、HC2—河南斗雞）。2）紅色箭頭處為mt.A4589G位點(diǎn)

表3 mt.A4589G變異在固始雞資源群的分布

AG代表異質(zhì)性個(gè)體AG represents the heterogeneous individuals

采用包含AA和AG型的家系進(jìn)行mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞F2代資源群的屠體性狀、生長(zhǎng)性狀、肉質(zhì)性狀以及血液生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞出生重、8周胸深、8周胸骨長(zhǎng)、8周脛長(zhǎng)、腿肌纖維直徑顯著相關(guān)（＜0.05）（表4），而與其它性狀關(guān)聯(lián)不顯著。

采用包含GG和AG型的家系進(jìn)行mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞F2代資源群的屠體性狀、生長(zhǎng)性狀、肉質(zhì)性狀以及血液生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞盲腸長(zhǎng)度、腹脂、腹脂率、皮下脂肪厚度、葡萄糖和乳酸脫氫酶顯著相關(guān)（＜0.05）（表5），而與其它性狀關(guān)聯(lián)不顯著。

表4 mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞F2代資源群性狀的關(guān)聯(lián)分析（包含AA和AG型的家系）

AA型、AG型兩列對(duì)應(yīng)的數(shù)值以LSM±S.E表示

The values corresponding to the two columns AA and AG are indicated by LSM±S.E

表5 mt.A4589G變異/異質(zhì)性與固始雞F2代資源群性狀的關(guān)聯(lián)分析(包含GG和AG型的家系)

GG型、AG型兩列對(duì)應(yīng)的數(shù)值以LSM±S.E表示

The values corresponding to the two columns GG and AG are indicated by LSM±S.E

2.5 mt.A4589G不同異質(zhì)性等級(jí)與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析

為進(jìn)一步掌握異質(zhì)性對(duì)性狀的效應(yīng)，本研究進(jìn)一步根據(jù)mt.A4589G中mt.4589A的比例對(duì)固始雞資源群F2代個(gè)體人為地進(jìn)行異質(zhì)性等級(jí)劃分，并進(jìn)行不同異質(zhì)性等級(jí)與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析。

在固始雞F2代資源群中，mt.A4589G不同異質(zhì)性等級(jí)與屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析表明（表6），該變異不同異質(zhì)性等級(jí)對(duì)腹脂、腹脂率的影響達(dá)到差異極顯著水平（＜0.01，異質(zhì)性等級(jí)高的個(gè)體腹脂重/腹脂率較高），對(duì)腿肌率、盲腸長(zhǎng)度的影響達(dá)到差異顯著水平（＜0.05），但對(duì)胸肌率、皮脂厚等其它屠體性狀指標(biāo)的效應(yīng)均未達(dá)到顯著水平，此外，對(duì)肌胃率、脾率和屠宰率（＜0.1）等呈現(xiàn)出相關(guān)的趨勢(shì)；mt.A4589G不同異質(zhì)性等級(jí)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析表明（表6），該變異不同異質(zhì)性等級(jí)對(duì)8周齡脛長(zhǎng)的影響達(dá)到差異顯著水平（＜0.05，異質(zhì)性等級(jí)高的個(gè)體脛長(zhǎng)較長(zhǎng)），但對(duì)脛圍、體斜長(zhǎng)等其它生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的效應(yīng)均未達(dá)到顯著水平，此外，對(duì)12周胸深和12周胸角（＜0.1）呈現(xiàn)出相關(guān)的趨勢(shì)；mt.A4589G不同異質(zhì)性等級(jí)與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析表明（表6）：該變異不同異質(zhì)性等級(jí)對(duì)肌纖維直徑、肌肉脂肪含量、肌肉的pH值、剪切力、失水率等肉質(zhì)性狀指標(biāo)的效應(yīng)均未達(dá)到顯著水平（＞0.05）；mt.A4589G不同異質(zhì)性等級(jí)與血液生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析表明（表6）：該變異不同異質(zhì)性等級(jí)對(duì)葡萄糖、淀粉酶的影響達(dá)到差異顯著水平（＜0.05，異質(zhì)性等級(jí)高的個(gè)體葡萄糖含量較低），但對(duì)總膽固醇、甘油三酯等其它血液生化指標(biāo)的效應(yīng)均未達(dá)到顯著水平，此外，對(duì)乳酸脫氫酶（＜0.1）呈現(xiàn)出相關(guān)的趨勢(shì)。

表6 mt.A4589G中mt.4589A的比例等級(jí)與固始雞資源群F2代性狀的關(guān)聯(lián)分析

1）同一行不同的小寫字母表示差異顯著（＜0.05），不同的大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）。2）表中異質(zhì)性比值為0代表的是GG基因型，100%代表的是AA基因型，異質(zhì)性比值=堿基A/（堿基A+堿基G）×100%

1) In the same line, different small letters means significantly (＜0.05), different capital letters means highly significantly (＜0.01). 2) In the table, the heteroplasmic ratio of 0 represents GG genotype, 100% represents AA genotype, and the heteroplasmic ratio= Base A / (Base A + Base G)×100%

3 討論

3.1 雞線粒體ND1基因A4589G異質(zhì)性在品種間的分布

對(duì)于mt.A4589G異質(zhì)性在不同品種間的分布研究，試驗(yàn)所選用的8個(gè)不同品種的雞，其樣本數(shù)介于8—12。PRUETT等[21]采用微衛(wèi)星分析表明，5—10個(gè)個(gè)體的小樣本即能夠無(wú)偏估計(jì)北美歌雀的雜合性。同樣，TRASK等[22]在猴子上的研究表明，檢測(cè)常見(jiàn)SNP和稀有SNP至少需要10個(gè)個(gè)體。這些報(bào)道皆顯示了小樣本估計(jì)群體遺傳多樣性的準(zhǔn)確性和可行性。

本研究中從8個(gè)品種間線粒體ND1基因上僅檢測(cè)出一個(gè)變異位點(diǎn)A4589G，顯示了ND1基因的保守性。ND1基因較為保守的原因，可能是由ND1的功能所決定的。在由線粒體DNA編碼的呼吸鏈復(fù)合物I中，ND1是核心亞基，在從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的進(jìn)化中都較為保守[23-24]。ND1的缺陷極有可能導(dǎo)致NADH脫氫酶全酶的缺乏[25]，同時(shí)ND1是泛醌的結(jié)合位點(diǎn)[26]，能夠促進(jìn)呼吸鏈中的電子傳遞。最近研究發(fā)現(xiàn)，ND1是維持親水性和疏水性呼吸鏈復(fù)合物I臂之間結(jié)構(gòu)和功能相互作用的關(guān)鍵亞基[23]，因而在自然選擇的情況下各物種ND1基因較為保守。

本研究發(fā)現(xiàn)mt.A4589G變異的分布具有明顯的品種特性。所檢測(cè)的地方品種雞（固始雞、河南斗雞、盧氏雞、絲羽烏骨雞和藏雞）的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，而國(guó)外品種雞（肉雞、白洛克和來(lái)航雞）的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳。其中，肉雞、白洛克具有生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，來(lái)航雞具有產(chǎn)蛋量高的特點(diǎn)，而本研究所涉及的相關(guān)地方雞種則生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)蛋量低，但耐粗飼、抗病性強(qiáng)，線粒體ND1基因mt.A4589G變異分布的地域/品種分布特性提示了該變異對(duì)相關(guān)生產(chǎn)性狀的重要效應(yīng)，可進(jìn)一步深入研究線粒體mt.A4589G不同的異質(zhì)性水平與不同雞品種相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，探究地方品種雞和國(guó)外品種雞該位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因不同的深層次原因。

本研究?jī)H從固始雞、河南斗雞和肉雞3個(gè)品種中檢測(cè)到5個(gè)AG異質(zhì)性個(gè)體，顯示mt.A4589G異質(zhì)性在自然群體里并不是一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象，其分布也具有一定的品種特性。比較有意思的是本研究發(fā)現(xiàn)mt.A4589G在固始雞資源群中存在較品種間更為廣泛的異質(zhì)性，提示mt.A4589G或其它位點(diǎn)異質(zhì)性在特定群體里富集的可能性。近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)人類線粒體異質(zhì)性并不是稀有的，而是一種常見(jiàn)現(xiàn)象[27-28]。本課題組[19]從不同品種線粒體ND2基因上也檢測(cè)到2個(gè)異質(zhì)性位點(diǎn)。

3.2 雞線粒體ND1基因異質(zhì)性對(duì)表型性狀的影響

RAMOS[29]等研究發(fā)現(xiàn)，人類線粒體基因組的異質(zhì)性在群體水平上具有較高頻率。目前，關(guān)于線粒體ND1基因異質(zhì)性的研究主要集中在人類疾病上。人類mtDNA中大多數(shù)的致病性突變都是異質(zhì)性的，它們的表型與異質(zhì)性水平密切相關(guān)[30]。通常，當(dāng)病理性的異質(zhì)性突變水平超過(guò)一定閾值（一般包含60%—95%的突變mtDNA）時(shí)，將會(huì)引起細(xì)胞的功能障礙，出現(xiàn)生化缺陷和相關(guān)癥狀[31]?，F(xiàn)已證明，人類ND1基因上的異質(zhì)性突變與帕金森病[32]、Leber遺傳性視神經(jīng)病變[33-35]和癌癥[36]有關(guān)。

目前，關(guān)于家禽線粒體ND1基因異質(zhì)性與性狀之間關(guān)聯(lián)性的研究鮮有報(bào)道。王佳偉[37]研究發(fā)現(xiàn)，30%的能量限制能夠?qū)е码u的肝組織中線粒體ND1基因的表達(dá)下調(diào)。MERLO等[38]發(fā)現(xiàn)衰老期間血小板中ND1基因的表達(dá)量顯著增加（＜0.05），推斷其轉(zhuǎn)錄的上調(diào)似乎能夠補(bǔ)償衰老過(guò)程中人血小板中的氧化磷酸化紊亂，表明ND1基因可能與能量代謝有關(guān)。魯衛(wèi)衛(wèi)等[39]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，mt.A5703T和mt.T5727G的異質(zhì)性與固始雞資源群F2代中的胸肌脂肪含量顯著相關(guān)。本研究通過(guò)mt.A4589G異質(zhì)性與固始雞F2代資源群性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)mt.A4589G異質(zhì)性與腹脂、血液中葡萄糖水平（GLU）等性狀顯著相關(guān)（＜0.05），顯示該變異/異質(zhì)性可能影響雞的腹脂的形成、腿肌的生長(zhǎng)發(fā)育以及機(jī)體的糖代謝，提示mt.A4589G異質(zhì)性可能通過(guò)影響葡萄糖代謝通徑從而影響機(jī)體的代謝水平和相關(guān)性狀的發(fā)育。然而對(duì)于線粒體ND1基因異質(zhì)性對(duì)雞能量代謝通徑影響的深層次機(jī)制以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等問(wèn)題，仍有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究檢測(cè)到mtND1基因上存在一個(gè)A4589G異質(zhì)性變異。利用PCR-RFLP法對(duì)mt.A4589G變異/異質(zhì)性在8個(gè)特色雞種間的分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)mt.A4589G變異/異質(zhì)性的分布具有明顯的品種特性，且mt.A4589G異質(zhì)性在自然群體的發(fā)生比例較低，而mt.A4589G在固始雞資源群中存在廣泛的異質(zhì)性，表明了異質(zhì)性在特定群體里富集的可能性。此外，進(jìn)行mt.A4589G異質(zhì)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)mt.A4589G變異/異質(zhì)性與腹脂、血液中葡萄糖水平（GLU）等性狀顯著相關(guān)（＜0.05）。

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The Variation/Heteroplasmy of Chicken Mitochondrial ND1 Gene and Its Association with Traits

XU Yuanyuan1, HOU LingLing2, JI JieFei1, WANG HuanJie1, LI SiLu1, CHEN Wen1, KANG XiangTao1, HUANG YanQun1

(1College of Livestock Husbandry and Veterinary Engineering, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2Xuchang Animal Husbandry Bureau (Municipal Animal Health Inspection Institute) , Xuchang 461099, Henan）

【】The purpose of this study was to investigate the heteroplasmy of mitochondrial ND1 gene in chickens and to study the distribution of mitochondrial heteroplasmy among different breeds and Gushi chicken resource population, and furthermore, to analysis the effects of mitochondrial heteroplasmy on valuable economic traits. 【】DNA extracted from blood samples of eight chicken breeds including Gushi chicken, Arbor Acres broiler chicken, Henan Cockfighting chicken, Lushi chicken, White Leghorn chicken, White Plymouth Rock chicken, Silkie chicken and Tibetan chicken, were used to study the distribution of mt.A4589G mutation/ heteroplasmy in natural populations by PCR-RFLP. In addition, DNA extracted from blood samples of Gushi chicken resource population constructed previously were used to study the distribution of mt.A4589G mutation/ heteroplasmy in Gushi chicken resource population by PCR-RFLP and to study the association analysis between mt.A4589G mutation/ heteroplasmy and F2traits of Gushi chicken resource population, including carcass traits, growth traits, meat quality indicators and blood biochemical indicators, thereby grasping the heteroplasmy of chicken mitochondrial ND1 gene and its potential effects; 【】1) Among eight breeds, one synonymous mutation mt.A4589G was detected from the full length of mitochondrial ND1 gene, and its distribution showed obvious variety characteristics. The dominant alleles of exotic breeds such as broiler chicken, White Plymouth Rock chicken and White Leghorn chicken were A, while domestic local breeds such as Silky chicken, Henan Cockfighting chicken and Lushi chicken were G. (2) The heteroplasmy of mt.A4589G in different breeds and Gushi chicken resource population was detected by PCR-RFLP. Among eight breeds, only five AG heterogeneous individuals were detected in Gushi chicken, Henan Cockfighting chicken and broiler chicken. In the Gushi chicken resource population, mt.A4589G had a wider heteroplasmy and the frequencies of heteroplasmy in F0, F1and F2generations were 0.81, 0.41 and 0.70, respectively. (3) The correlation analysis between mt.A4589G heteroplasmy and F2traits of Gushi chicken resource population showed that mt.A4589G heteroplasmy was significantly correlated with abdominal fat, sebum thickness eight-week-old shank length, diameter of leg muscle fiber and glucose levels in the blood (＜0.05). (4) The correlation analysis between the levels of heteroplasmy of mt.A4589G and F2traits of Gushi chicken resource population indicated that the levels of heteroplasmy was significantly correlated with carcass traits, growth traits and serum biochemical indicators (＜0.05). 【】mt.A4589G is a heteroplasmic variation, and its heteroplasmic distribution exhibits obvious variety characteristics. The mt.A4589G heteroplasmy of the natural population occurs less frequently, while mt.A4589G has a wider heteroplasmy in the Gushi chicken resource population. Furthermore, through the correlation analysis between the heteroplasmy of mt.A4589G and the F2traits of Gushi chicken resource population, it was found that the mt.A4589G mutation/heterogeneity was significantly correlated with the abdominal fat and the glucose level in the blood (＜0.05).

chicken; ND1 gene; PCR-RFLP; heteroplasmy; association analysis

2018-09-18；

2019-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272434）

徐媛媛，Tel：13598836740；E-mail：994431047@qq.com。

黃艷群，Tel：13838074456；E-mail：hyanqun@aliyun.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）