一株多形炭角菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

何山文 雷 瓊 馬立安*

（1長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；2荊州文物保護(hù)中心，湖北荊州434020）

多形炭角菌（Xylaria polymorpha）屬于菌物界，子囊菌門(mén)，盤(pán)菌亞門(mén)，糞殼菌綱，炭角菌亞綱，炭角菌目，炭角菌科，炭角菌屬。多形炭角菌主要生長(zhǎng)于林間腐木、樹(shù)皮裂縫中[1]。研究表明，多形炭角菌具有藥用價(jià)值[2]，是天然產(chǎn)物的豐富來(lái)源。JANG等[3-4]不僅從多形炭角菌子實(shí)體的甲醇提取物分離到亞油酸、亞油酸甲酯及麥角甾醇等多種生物活性物質(zhì)，還分離到2種聚丙酸酯xylarinic acids A和B（具有清除自由基、抗真菌與抗炎活性）。楊寧寧等[5]從多形炭角菌菌絲發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯部分中分離鑒定出具有乙酰膽堿酯酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗線蟲(chóng)活性的新物質(zhì)。由于多形炭角菌的資源比較匱乏，難以大量收集，其大規(guī)模開(kāi)發(fā)利用受到限制。

筆者對(duì)一株疑似炭角菌屬的大型野生真菌進(jìn)行組織分離，并通過(guò)真核生物核糖體基因ITS序列對(duì)其進(jìn)行鑒定并研究其培養(yǎng)特性，為其人工馴化栽培及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株采自英國(guó)諾里奇東安吉利亞大學(xué)校區(qū)林間的野生大型真菌（圖1），保存于長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，去離子水1000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化

將野生菌進(jìn)行酒精消毒后，取子實(shí)體部分接于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接2～3次，經(jīng)鏡檢無(wú)雜菌后即得到純化的菌株，編號(hào)為T(mén)-18。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，7 d后觀察記錄菌落特征、菌絲形態(tài)。

1.2.3 分子系統(tǒng)鑒定

將菌絲置于PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，離心取出菌絲后采用改良的CTAB法[6]提取DNA。PCR擴(kuò)增引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，PCR 反應(yīng)體系（50 μL），其體系為 10×Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Taq（2 U/μL）1 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 33 μL，DNA模板4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。0.8%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 菌絲生長(zhǎng)特性研究

保存的菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d進(jìn)行活化。取1 cm2左右活化菌種接種進(jìn)裝有150 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，放置于25℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的溫控?fù)u床培養(yǎng)5 d，制成種子液備用。

1.2.4.1 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

以不加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，以相同含碳量的蔗糖、乳糖、麥芽糖、α-可溶性淀粉分別代替葡萄糖，共6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)基裝液量50 mL/100 mL三角瓶，等量接種，放置于25℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取發(fā)酵液過(guò)濾，收集菌絲體。菌絲體于50℃烘干12 h至恒重后稱(chēng)重。計(jì)算菌絲體產(chǎn)量（平均每100 mL發(fā)酵液得到的菌絲體干重）。

1.2.4.2 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

以不加蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，以相同含氮量的牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉分別代替蛋白胨，研究氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。共7個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

以不加磷酸二氫鉀和硫酸鎂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，選用硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸鉀6種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.4 溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35℃，共6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.4.5 pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH設(shè)置為3、4、5、6、7、8、9，每個(gè)處理3次重復(fù)。其他步驟同1.2.4.1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

以菌絲體生物量作為指標(biāo)，繪制柱狀圖。采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法比較各因素對(duì)菌絲產(chǎn)量的差異顯著性影響。

圖1 樣品子實(shí)體形態(tài)

圖2 樣品菌落平板形態(tài)

圖3 ITS片段PCR產(chǎn)物電泳圖

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品形態(tài)學(xué)鑒定

樣品子實(shí)體菌落形態(tài)如圖1、2所示。頭部呈橢圓形或卵圓形或近球形，飽滿肥厚，呈顆粒狀簇生在一起，表皮黑褐色、光滑，內(nèi)部呈白色，有濃郁的香氣。菌絲體呈樹(shù)枝狀，由根部往上生長(zhǎng)分出若干分枝。菌絲體表皮呈黑褐色，帶黑色斑點(diǎn)，末端白色，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)分泌出水滴狀液體。

2.2 野生菌株的ITS序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，可見(jiàn)約600 bp的目的條帶，條帶明亮清晰，無(wú)拖尾，見(jiàn)圖3。測(cè)序獲得野生菌株的ITS區(qū)域核酸序列，共579 bp。提交至GenBank獲得基因號(hào)為KF897015。下載與其同源性較高的菌株序列作為參考，用Mega 5.1軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示。與登錄號(hào)為FM164944.1的多形炭角菌（Xylaria polymorpha）的DNA序列同源性為99%。結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果，鑒定該菌為多形炭角菌（Xylaria polymorpha），屬于炭角菌目，炭角菌科，炭角菌屬。

圖4 T-18的16 s基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖5所示。該菌株在5種供試碳源中均可生長(zhǎng)，表明該菌株菌絲對(duì)單糖、雙糖及多糖均能利用，但菌絲長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)存在差異。該菌株以葡萄糖作為碳源時(shí)菌絲生物量最大，達(dá)到466 mg/100 mL，且與其他碳源相比，差異顯著（P＜0.01）。因此，葡萄糖為菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源。

圖5 不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.4 不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖6所示。結(jié)果表明，多形炭角菌菌絲體在6種供試氮源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但不同氮源對(duì)菌絲體生物量的影響有差異，其中以牛肉膏為氮源的菌絲體生物量最高，達(dá)到327 mg/100 mL。無(wú)機(jī)氮源中，除硫酸銨組外，供試氮源與空白對(duì)照菌絲體生物量差異均顯著（P＜0.05），但沒(méi)有達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

圖6 不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.5 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖7所示。結(jié)果表明，其中以KH2PO4和MgSO4為無(wú)機(jī)鹽的菌絲體生物量較大，分別達(dá)到351 mg/100 mL和346 mg/100 mL，而以硫酸鋅為無(wú)機(jī)鹽的菌絲體生物量最少，只有32 mg/100 mL。

2.6 不同pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖8所示。結(jié)果表明，多形炭角菌菌絲體在供試pH為4～9的培養(yǎng)基都能生長(zhǎng)。培養(yǎng)基在pH 7時(shí)菌絲體生物量最高，達(dá)到386 mg/100 mL，pH 3時(shí)菌絲體生物量最低，為169 mg/100 mL。培養(yǎng)基pH偏酸或偏堿時(shí)，都不適宜菌絲體生長(zhǎng)。因此可將pH 7選為多形炭角菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最適pH。

圖7 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

圖8 不同pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

2.7 不同溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同溫度對(duì)多形炭角菌菌絲體生物量影響如圖9所示。培養(yǎng)溫度15～25℃，隨著溫度的上升，菌絲生長(zhǎng)速度加快，于25℃時(shí)菌絲體生物量最高，達(dá)到424 mg/100 mL，與其他溫度相比均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。因此，最適培養(yǎng)溫度為25℃。

圖9 不同溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

3 小結(jié)與討論

天然藥用炭角菌資源非常稀少，子實(shí)體的人工栽培技術(shù)尚未成熟，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行液體深層發(fā)酵，可以得到大量的菌絲體和代謝產(chǎn)物[7]。探究多形炭角菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)條件和最適環(huán)境條件，了解其生長(zhǎng)特性，提高菌絲體產(chǎn)量，對(duì)炭角菌研究具有重要意義。多形炭角菌液體培養(yǎng)最佳碳源為葡萄糖，結(jié)果與欒洋等[8]的報(bào)道類(lèi)似。炭角菌不僅能通過(guò)滲透作用直接吸收單糖，而且能分泌淀粉酶等胞外酶，將淀粉等分解成葡萄糖后吸收[9]。菌絲體能有效利用有機(jī)氮，而幾乎不能利用無(wú)機(jī)氮源。分析原因可能是由于有機(jī)氮除提供氮源外，還提供一定的碳素營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，從而促使?fàn)I養(yǎng)平衡和物質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。供試無(wú)機(jī)鹽中磷酸二氫鉀、硫酸鎂對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，K、Mg、P是多形炭角菌生長(zhǎng)必需的大量元素。

野生菌株T-18屬于多形炭角菌（Xylaria polymorpha），菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25℃，最適pH為7.0，最適碳、氮源分別為葡萄糖和牛肉膏，添加一定量的MgSO4和KH2PO4有利于菌絲體的生長(zhǎng)。