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      毛木耳多糖復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化提取工藝研究

      2019-08-27 06:35:00
      食用菌 2019年4期
      關(guān)鍵詞:發(fā)酵罐木耳酵母

      孫 海 黃 榮

      (成都正仁宇澤生物科技有限公司,四川成都610081)

      毛木耳(Auricularia polytricha)又稱黃背木耳、粗木耳等,屬于擔(dān)子菌綱,木耳目,木耳科,木耳屬中的毛木耳種[1]。野生毛木耳主要分布在四川、云南、福建等低海拔溫暖濕潤(rùn)山區(qū)。其規(guī)?;^(qū)域性栽培地主要集中在四川省什邡市和福建省部分區(qū)域。毛木耳子實(shí)體膠質(zhì)滑韌,子實(shí)體背面富有絨毛,營(yíng)養(yǎng)豐富,含木耳多糖、麥角甾醇、氨基酸、脂質(zhì)體、纖維素、胡蘿卜素、維生素A、B1、B2及各種無機(jī)元素鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、鋅、錳、磷等營(yíng)養(yǎng)成分,素有“黑色保健食品”和“樹上海蜇皮”之美稱,有補(bǔ)氣血、降血液黏度、降血脂、清肺潤(rùn)燥、清滌胃腸、通便降壓、化結(jié)石、抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和心肌梗死等功效[2-3]。毛木耳的多種藥效與其含有豐富的多糖密切相關(guān)。毛木耳多糖屬于酸性雜多糖,是由五種單糖和葡萄糖醛酸組成[4]。木耳多糖具有止血、抗凝血和降血脂、抗衰老、改善心臟功能、免疫及抗腫瘤功能、對(duì)機(jī)體細(xì)胞有保護(hù)等多種作用[5]。

      毛木耳多糖提取是多糖廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ),因此獲得高效的毛木耳多糖提取技術(shù)尤為重要。目前國(guó)內(nèi)還沒有統(tǒng)一的毛木耳多糖產(chǎn)業(yè)化提取工藝,已有浸提方法提取毛木耳多糖工藝耗時(shí)、耗能、低效,而且對(duì)環(huán)境的影響較大,工業(yè)化生產(chǎn)難度較高。研究利用復(fù)合酶酶解、酵母恒溫恒壓發(fā)酵來提取四川省什邡產(chǎn)野生毛木耳中多糖,并確定最佳產(chǎn)業(yè)化制備工藝條件。該方法利用復(fù)合酶酶解毛木耳的不溶性纖維、膠質(zhì)和植物蛋白成分,并通過酵母發(fā)酵使毛木耳組織蓬松(酵母與糖分解產(chǎn)生二氧化碳和乙醇,加大罐內(nèi)壓力,增強(qiáng)組織滲透壓力)和細(xì)胞壁膨脹破裂有利于充分提取毛木耳中的多糖成分[6],使工藝更具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢(shì),同時(shí)降低能耗并改善環(huán)境污染。為優(yōu)化毛木耳多糖的提取工藝提供參考,同時(shí)為毛木耳多糖的綜合開發(fā)和深加工奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      材料與試劑:毛木耳(四川什邡市澗氐鎮(zhèn)木耳種植協(xié)會(huì)提供);纖維素酶(2萬U/克)、中性蛋白酶(3萬U/克)、果膠酶(3萬U/克),南寧龐博生物工程有限公司;安琪低糖型酵母,安琪酵母股份有限公司;無水葡萄糖,成都科倫醫(yī)藥有限公司;其他藥品均為市售分析純。

      設(shè)備儀器:恒溫恒濕發(fā)酵罐5 L,江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司;錐型過濾桶5 L,溫州伯泰機(jī)械科技有限公司;濃縮罐10 L,溫州伯泰機(jī)械科技有限公司;BLK-FD-100真空減壓干燥箱,江蘇昌實(shí)干燥科技有限公司;KH30RF離心機(jī),湖南凱達(dá);754N紫外-可見分光度計(jì),山東晨托科學(xué)儀器設(shè)備有限公司;電子天平,杭州友恒稱量?jī)x器有限公司;粉碎機(jī),溫嶺奧力中藥機(jī)械設(shè)備有限公司。

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 原材料預(yù)處理

      野生黃背毛木耳洗凈后晾干,剔除發(fā)霉、變質(zhì)等不合格木耳及雜質(zhì),將干木耳粉碎,過10目篩,制成干木耳粉,置于干燥陰涼處備用。

      1.2.2 毛木耳多糖提取率的計(jì)算

      毛木耳多糖含量的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[6-7],采用苯酚—硫酸法測(cè)定毛木耳多糖含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=14.86C-0.024,相關(guān)系數(shù)r2=0.9979,線性范圍在0~100 μg/mL,如圖1所示,并計(jì)算毛木耳多糖提取率。

      多糖含量(%)=(C×D×F)/W×100

      上式中:C為試液中的葡萄糖濃度(mg/L),D為多糖的稀釋因素,F(xiàn)為換算因子,W為毛木耳質(zhì)量。

      1.2.3 毛木耳多糖兩種提取方法比較

      在實(shí)驗(yàn)室少量樣品試驗(yàn)基層上,進(jìn)行5 kg料和50 kg料擴(kuò)大試驗(yàn)。

      1.2.3.1 回流提取法

      取毛木耳樣品1.0 g,配制成一定液料比的溶液,經(jīng)過回流浸提,將提取液離心取上清液、濃縮、后加入4倍95%濃度乙醇靜置沉淀多糖、冷凍離心、干燥得到黃背毛木耳多糖。

      按上述工藝分別進(jìn)行5 kg和50 kg中試提取試驗(yàn)。

      工藝流程:

      原料處理→加水混合(加水量通常80%~100%)→加熱回流(70℃)→回收回流液→調(diào)節(jié)pH(6~8)→濃縮1/6→醇析→干燥→粉碎→制得多糖粗品

      1.2.3.2 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流提取法

      取毛木耳樣品1.0 g,按料液比為1∶35配成溶液,然后加入0.1 g一定量的復(fù)合酶(纖維素酶∶中性蛋白酶∶果膠酶=0.6∶0.4∶0.8)酶活力(2600U),在溫度為80℃,pH為6.0的條件下酶解80 min高溫滅酶后再用安琪低糖型酵母在發(fā)酵壓力0.15~0.2 MPa,溫度為40℃,發(fā)酵20 h,在回流溫度60℃經(jīng)過回流浸提120 min,將提取液離心取上清液、濃縮后加入4倍95%乙醇靜置沉淀多糖、冷凍離心、干燥得到黃背毛木耳多糖。

      按上述工藝分別進(jìn)行5 kg和50 kg中試提取試驗(yàn)。

      工藝流程:

      原料處理→干燥→粉碎(10目)→稱量→酶解→發(fā)酵→回流浸提→過濾→離心取上清液→濃縮至1/4→調(diào)節(jié)pH至6~8→醇析→真空減壓干燥→粗品→粉碎→得毛木耳多糖

      1.2.4 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵法回流提取法(單因素試驗(yàn))

      分別將纖維素酶、中性蛋白酶、果膠酶作為水解用酶,然后用安琪低糖型酵母發(fā)酵,以酶解時(shí)間、酶解溫度、罐內(nèi)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵罐壓力、回流浸提時(shí)間、回流溫度、料液比為可變因素,研究各因素對(duì)多糖得率的影響,得到優(yōu)化的提取工藝。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 兩種提取方法毛木耳多糖提取率

      采用回流提取法(5 kg和50 kg料),其多糖提取率分別為1.42%和1.40%;采用復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流法(5 kg和50 kg),其多糖提取率分別為3.60%和3.59%。

      采用復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流法新工藝,有以下優(yōu)勢(shì):①粗多糖提取率高于傳統(tǒng)工藝>150%;②減少用水量,降低環(huán)境污染因素;③減少了乙醇用量,提高了生產(chǎn)效能;④提高了生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效能,更利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

      2.2 復(fù)合酶解-酵母發(fā)酵回流提取法單因素試驗(yàn)結(jié)果

      2.2.1 酶解溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表1可見,在相同發(fā)酵條件、回流浸提時(shí)間溫度、料液比、酶解時(shí)間為80 min條件下,毛木耳多糖提取率隨著酶解溫度上升而上升,但溫度升高到90℃,提取率反而下降。酶解溫度在80℃時(shí)提取率最高,而且回流浸提良好,回流速度均勻。優(yōu)選方案為:酶解溫度為80℃,酶解時(shí)間為80 min。

      表1 酶解溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.2.2 罐內(nèi)發(fā)酵溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      在人口老齡化加速席卷全球的客觀條件下,不僅我國(guó)面臨著處理職工退休的問題,世界各國(guó)同樣面對(duì)著這個(gè)問題,相對(duì)于我國(guó)進(jìn)入人口老齡化的速度,美國(guó)與日本等國(guó)家首當(dāng)其沖,率先面臨著人口老齡化帶來的危機(jī)。因此,借鑒國(guó)外延遲退休年齡政策在實(shí)踐中的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),對(duì)于我國(guó)制定符合中國(guó)國(guó)情的延遲退休年齡政策,有著不言而喻的重要性。

      由表2可見,在酶解溫度為80℃,相同時(shí)間、壓力其他條件不變條件下,隨著罐內(nèi)發(fā)酵溫度上升,毛木耳多糖提取率先高后低,發(fā)酵溫度在40℃時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案:發(fā)酵溫度為40℃。

      表2 罐內(nèi)發(fā)酵溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表3可見,在酶解溫度為80℃,發(fā)酵溫度為40℃,其他條件不變,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),毛木耳多糖提取率先高后低,發(fā)酵時(shí)間在20 h時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案:發(fā)酵時(shí)間為20 h。

      表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.2.4 發(fā)酵罐壓力對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表4可見,在酶解溫度為80℃,發(fā)酵溫度為40℃,發(fā)酵時(shí)間20 h,其他條件不變,隨著發(fā)酵罐壓力上升,毛木耳多糖提取率先高后低,發(fā)酵罐壓力維持在0.15 MPa、0.2 MPa時(shí),毛木耳多糖提取率較高,并且不影響其他工藝。優(yōu)選方案:罐內(nèi)壓力維持在0.15~0.2 MPa。

      表4 發(fā)酵罐壓力對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.2.5 回流浸提時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表5可見,在酶解溫度為80℃,發(fā)酵溫度為40℃,發(fā)酵時(shí)間20 h,罐內(nèi)壓力維持在0.15~0.2 MPa,其他條件不變,隨著回流浸提時(shí)間延長(zhǎng),毛木耳多糖提取率先上升后下降,回流浸提時(shí)間在120 min、150 min時(shí),提取率較高。優(yōu)選方案:從能耗角度考慮優(yōu)選回流浸提時(shí)間為120 min。

      表5 回流浸提時(shí)間對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表6可見,在酶解溫度為80℃,發(fā)酵溫度為40℃,發(fā)酵時(shí)間20 h,罐內(nèi)壓力維持在0.15~0.2 MPa,回流浸提時(shí)間120 min,其他條件不變,隨著回流浸提溫度上升,毛木耳多糖提取率先高后低,回流浸提溫度60℃時(shí)提取率最高。優(yōu)選方案:回流浸提溫度為60℃。

      表6 回流浸提溫度對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.2.7 料液比對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      由表7可見,在酶解溫度為80℃,發(fā)酵溫度為40℃,發(fā)酵時(shí)間20 h,罐內(nèi)壓力維持在0.15~0.2 MPa,回流浸提時(shí)間120 min,回流浸提溫度為60℃,其他條件不變,在料液比為1∶30~1∶50多糖提取率均高于3%,而且回流液正常。優(yōu)選方案:考慮能耗與環(huán)保因素,取料液比為1∶35。

      表7 料液比對(duì)毛木耳多糖提取率的影響

      2.3 優(yōu)選條件下毛木耳多糖提取率

      以酶解時(shí)間80 min、酶解溫度80℃、發(fā)酵溫度40℃,發(fā)酵時(shí)間20 h,發(fā)酵壓力0.15~0.2 MPa,回流浸提時(shí)間120 min,回流溫度60℃,料液比為1∶35提取毛木耳多糖,重復(fù)5次。結(jié)果毛木耳多糖提取率分別為3.45%、3.43%、3.42%、3.46%、3.41%,平均值3.43%。

      3 小結(jié)

      單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,酶解溫度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、罐內(nèi)壓力、回流浸提時(shí)間、溫度以及料液比對(duì)毛木耳多糖提取率影響較大,優(yōu)選條件下5次毛木耳多糖提取率較為穩(wěn)定,表明該工藝較為成熟。該工藝已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模生產(chǎn)驗(yàn)證階段。

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