茶堿激活型RNA分子開(kāi)關(guān)的構(gòu)建及在枯草芽胞桿菌中調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的性能

繆勝男，楊婷堯，崔文璟，周哲敏

茶堿激活型RNA分子開(kāi)關(guān)的構(gòu)建及在枯草芽胞桿菌中調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的性能

繆勝男，楊婷堯，崔文璟，周哲敏

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

枯草芽胞桿菌在工業(yè)生物技術(shù)以及合成生物學(xué)領(lǐng)域作為一種重要的微生物可廣泛用作代謝工程、重組蛋白表達(dá)以及新型基因電路的底盤(pán)。在中構(gòu)建基于非編碼RNA的高精準(zhǔn)調(diào)節(jié)元件，能夠?qū)崿F(xiàn)不依賴(lài)蛋白質(zhì)因子的基因表達(dá)調(diào)控，豐富基因表達(dá)通用工具。通過(guò)基因工程手段，設(shè)計(jì)了基于茶堿適體域的核糖開(kāi)關(guān)E和適體核酶AZ調(diào)節(jié)元件，并與不同的內(nèi)源組成型啟動(dòng)子適配，構(gòu)建出茶堿激活型基因表達(dá)控制元件。測(cè)定這兩種調(diào)節(jié)元件與6種組成型啟動(dòng)子組合匹配下報(bào)告基因GFP的熒光強(qiáng)度，鑒定并分析各調(diào)控元件的工作性能。并進(jìn)一步以紅色熒光蛋白mCherry和普魯蘭酶兩種不同的異源蛋白驗(yàn)證核糖開(kāi)關(guān)或適體核酶與啟動(dòng)子的最優(yōu)組合。結(jié)果表明，同一種RNA調(diào)節(jié)元件與不同啟動(dòng)子組合呈現(xiàn)不同水平的調(diào)控效率。在核糖開(kāi)關(guān)與啟動(dòng)子的組合中，啟動(dòng)子PsigW和核糖開(kāi)關(guān)E組合 (sigWE) 對(duì)GFP表達(dá)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到16.8。在適體核酶與啟動(dòng)子的組合中，AZ與啟動(dòng)子P43、PrpoB組合 (P43AZ和rpoBAZ) 的誘導(dǎo)率最高，分別達(dá)到了6.1和6.2。進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，sigWE調(diào)控mCherry的誘導(dǎo)率最高 (9.2)，而P43E調(diào)控普魯蘭酶的誘導(dǎo)率最高 (32.8)，產(chǎn)酶水平達(dá)到了81 U/mL。核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶對(duì)GFP、mCherry、普魯蘭酶均能實(shí)現(xiàn)調(diào)控，但是不同元件組合的調(diào)控性能有所差異，對(duì)不同基因的調(diào)控效果也不盡相同。

核糖開(kāi)關(guān)，適體核酶，枯草芽胞桿菌，基因調(diào)控

枯草芽胞桿菌作為一種重要的革蘭氏陽(yáng)性模式菌，是外源基因高效表達(dá)、實(shí)現(xiàn)工業(yè)酶高效生產(chǎn)和代謝工程的理想宿主。枯草芽胞桿菌也可作為合成微生物底盤(pán)，用于承載人工設(shè)計(jì)的基因電路，實(shí)現(xiàn)天然系統(tǒng)不能夠完成的新功能[1-3]。近年隨著遺傳工具的不斷擴(kuò)展，諸如各種不同調(diào)控類(lèi)型的啟動(dòng)子、標(biāo)準(zhǔn)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及部分ρ因子非依賴(lài)型終止子的構(gòu)建、開(kāi)發(fā)和鑒定[4]，這一宿主已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是一種能與大腸桿菌相媲美的合成生物學(xué)底盤(pán)。

細(xì)菌通過(guò)基因調(diào)控來(lái)應(yīng)對(duì)自身代謝和周?chē)h(huán)境的變化，因此基因調(diào)控對(duì)于合理應(yīng)用體內(nèi)物質(zhì)和能量具有重要意義[5]，同時(shí)基因表達(dá)調(diào)控在蛋白質(zhì)表達(dá)、代謝工程、合成生物學(xué)領(lǐng)域也多有應(yīng)用。已有的基因表達(dá)工具多依賴(lài)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)調(diào)控，這種系統(tǒng)需要一個(gè)或多個(gè)輔助蛋白來(lái)激活目標(biāo)基因表達(dá)[6]。其中最經(jīng)典的就是受IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，IPTG通過(guò)與轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白LacI結(jié)合，使LacI從操縱位點(diǎn)上脫離下來(lái)從而誘導(dǎo)下游基因，但是IPTG誘導(dǎo)對(duì)菌體造成生長(zhǎng)壓力，會(huì)阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)；另一種常用的受木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，通過(guò)與XylR阻遏蛋白相互作用進(jìn)行調(diào)控，但是木糖誘導(dǎo)調(diào)控會(huì)參與代謝途徑，產(chǎn)生相互干擾。RNA元件因?yàn)橄到y(tǒng)元件小，構(gòu)成簡(jiǎn)單，無(wú)需蛋白參與逐漸成為研究熱點(diǎn)，通過(guò)在mRNA上融合適體域，使其對(duì)相應(yīng)配體的存在作出響應(yīng)，從而調(diào)控基因表達(dá)[7]。

用于調(diào)控原核生物基因表達(dá)的非編碼RNA元件有多種，其中應(yīng)用最廣泛的有兩類(lèi)：核糖開(kāi)關(guān)(Riboswitch) 和適體核酶(Aptazyme)[8-11]。核糖開(kāi)關(guān)由一個(gè)可以響應(yīng)高親和力配體的適體域(Aptamer) 和表達(dá)平臺(tái)域組成；通過(guò)利用適體域區(qū)域固有的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)識(shí)別特異性的配體并結(jié)合配體[12]，能夠感知配體的濃度。核糖開(kāi)關(guān)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均可實(shí)現(xiàn)調(diào)控[13]，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是通過(guò)在表達(dá)平臺(tái)域形成終止子或者抗終止子影響RNA聚合酶的功能，從而引起轉(zhuǎn)錄的終止或激活[14-15]；翻譯水平的調(diào)控通過(guò)配體和適體域的結(jié)合改變莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而暴露或者隱藏SD序列，激活或終止翻譯的進(jìn)行。核糖開(kāi)關(guān)現(xiàn)已在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等其他菌株中作為調(diào)控元件調(diào)控外源基因的表達(dá)。Mandal等[16]發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了受甘氨酸調(diào)控的天然核糖開(kāi)關(guān)，通過(guò)配體結(jié)合兩個(gè)適體域后的協(xié)同作用來(lái)確保多余的甘氨酸能一方面作為檸檬酸循環(huán)的碳源，另一方面用來(lái)維持足夠的氨基酸保證蛋白質(zhì)的合成。Amy等[17]在藍(lán)藻中通過(guò)篩選和合理設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了茶堿核糖開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)了翻譯水平上的調(diào)控；Cui等[18]進(jìn)一步證明茶堿誘導(dǎo)型核糖開(kāi)關(guān)能在枯草芽胞桿菌中被成功激活，同時(shí)核糖開(kāi)關(guān)具有配體依賴(lài)性。

適體核酶是人工設(shè)計(jì)出來(lái)的由天然或改造后的核酶(Ribozyme) 以及不同適體域組合而成的新型元件。其中，錘頭狀核酶是小型的自分裂RNA，首次在類(lèi)病毒和植物病毒的RNA中發(fā)現(xiàn)[19]，可催化特定磷酸二酯鍵在轉(zhuǎn)環(huán)復(fù)制過(guò)程中的異構(gòu)化反應(yīng)。適體核酶具有作用方式多樣、調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)、結(jié)構(gòu)高度模塊化等特點(diǎn)[20]，既能和配體高特異性結(jié)合，又有核酶的催化活性。在無(wú)配體存在時(shí)，不具有或者具有較低的活性，而在配體存在時(shí)，配體會(huì)與適體核酶上的適體域結(jié)合從而誘發(fā)核酶的自我裂解作用，由無(wú)活性轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)，從而發(fā)揮對(duì)下游基因的調(diào)控作用。Wieland等[21]通過(guò)在錘頭狀核酶的莖環(huán)Ⅲ上融合茶堿適體域，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)對(duì)GFP表達(dá)的調(diào)控。RNA元件的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)一步拓展了人們對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)知，而且RNA元件作為一種基因功能研究的工具，對(duì)于特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用具有重要意義。

上游啟動(dòng)子對(duì)于核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶調(diào)控蛋白的性能會(huì)產(chǎn)生很大影響。因此本研究通過(guò)在枯草芽胞桿菌中將核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶與不同的組成型啟動(dòng)子進(jìn)行匹配，分析啟動(dòng)子兼容性對(duì)調(diào)節(jié)元件的影響，對(duì)RNA元件的性質(zhì)進(jìn)行分析；同時(shí)分析了適體核酶和核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控不同蛋白的適用性，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶堿核糖開(kāi)關(guān)和茶堿適體核酶能夠與多種來(lái)源的內(nèi)源啟動(dòng)子匹配，但不同啟動(dòng)子與核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶匹配后呈現(xiàn)的調(diào)控性能有差異；茶堿核糖開(kāi)關(guān)和茶堿適體核酶對(duì)GFP、mCherry、普魯蘭酶均能實(shí)現(xiàn)調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒詳見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；2*GenRec重組試劑盒購(gòu)自通用生物系統(tǒng)(安徽) 有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京) 有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；DMSO、茶堿購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司。PCR儀、蛋白電泳儀購(gòu)自BIO-RAD公司；分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTeck公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒pBSG03A (由P43啟動(dòng)子控制GFP表達(dá)的大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭表達(dá)載體) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。以該質(zhì)粒為模板采用定點(diǎn)突變和Infusion重組的方式構(gòu)建突變體，所構(gòu)建的質(zhì)粒如表1所示，表2為構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒時(shí)的引物。在PCR得到的基因產(chǎn)物中加入Ⅰ酶反應(yīng)2 h以消除模板，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后對(duì)其進(jìn)行基因組裝，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒測(cè)序，待序列驗(yàn)證正確后，再將其轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌，進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 本研究所用質(zhì)粒

1.2.2 茶堿核糖開(kāi)關(guān)的構(gòu)建

基于茶堿調(diào)控的核糖開(kāi)關(guān)(圖1) 在未加入茶堿時(shí)，SD被隱藏在莖環(huán)內(nèi)，核糖體無(wú)法結(jié)合SD，基因無(wú)法進(jìn)行表達(dá)；加入茶堿配體后，核糖開(kāi)關(guān)構(gòu)象發(fā)生改變，SD被暴露出來(lái)，翻譯開(kāi)始進(jìn)行。根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物(表2)，以質(zhì)粒pBSG11/pP43EGFP[18]為模板進(jìn)行PCR，獲得含有不同啟動(dòng)子與茶堿核糖開(kāi)關(guān)E組合匹配的重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入168中，獲得含有茶堿核糖開(kāi)關(guān)與不同啟動(dòng)子組合匹配的基因工程菌。

表2 本研究所用引物序列

圖1 茶堿核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)原理示意圖

1.2.3 茶堿適體核酶的構(gòu)建

基于茶堿調(diào)控的適體核酶(圖2) 在未加入配體時(shí)，SD被隱藏在莖環(huán)內(nèi)，核糖體無(wú)法結(jié)合SD，基因無(wú)法進(jìn)行表達(dá)；加入茶堿配體后，構(gòu)象發(fā)生改變，核酶發(fā)生自我剪切，SD暴露出來(lái)，翻譯開(kāi)始進(jìn)行。根據(jù)Aptamer Database所提供的茶堿適體域序列和來(lái)源于曼氏血吸蟲(chóng)的錘頭狀核酶序列設(shè)計(jì)適體核酶序列并化學(xué)合成，獲得含適體核酶序列的質(zhì)粒pUCSmTheo-AZ。然后利用引物sm-aptazyme-F/sm-aptazyme-R (表2)，以pUCSmTheo- AZ為模板進(jìn)行PCR，獲得含有適體核酶序列的片段PAZSDE1，回收并純化，再以該片段作為大引物，pBSG03A質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pP43AZGFP-A；以重組表達(dá)質(zhì)粒pP43AZGFP-A為模板，用引物SDE1 CM 6N對(duì)通信模塊(Communication module，CM)部分進(jìn)行PCR建庫(kù)篩選(方法1.2.4) 獲得具有調(diào)控功能的質(zhì)粒pP43AZGFP/pP43AZGFP-CM3nt-BG8。再將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入.168中，即得基因工程菌PBP43AZGFP。再根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物(表2)，以質(zhì)粒pP43AZGFP為模板，進(jìn)行PCR，獲得含有不同啟動(dòng)子與茶堿適體核酶AZ組合匹配的重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入168中，獲得含有茶堿適體核酶與不同啟動(dòng)子組合匹配的基因工程菌。

圖2 茶堿適體核酶調(diào)控基因表達(dá)原理示意圖

1.2.4 茶堿適體核酶通信模塊文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

茶堿適體核酶的適體域和核酶結(jié)構(gòu)依靠?jī)烧咧g的通信模塊連接[22]。適體域結(jié)合茶堿后，將RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化通過(guò)CM傳遞給核酶，從而使核酶從無(wú)活性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨淖粤呀鉅顟B(tài)，釋放被封閉的SD序列，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯。本研究中為了獲得高效的CM，設(shè)計(jì)了3–5 nt的隨機(jī)序列作為CM，構(gòu)建CM文庫(kù)。以重組表達(dá)質(zhì)粒pP43AZGFP-A為模板，用引物SDE1 CM 6N (表2) 進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物用Ⅰ消化2 h，轉(zhuǎn)入JM109，收集平板上所有菌落，提取總質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入168。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取不同單菌落于96深孔板中培養(yǎng)12 h，取樣，檢測(cè)600和GFP表達(dá)；然后在96深孔板中添加終濃度4 mmol/L的茶堿，再培養(yǎng)12 h，取樣，檢測(cè)600和GFP表達(dá)。

1.2.5 綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白mCherry報(bào)告基因表達(dá)水平的測(cè)定

將測(cè)序正確的枯草芽胞桿菌在平板劃線(xiàn)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，再以1%的接種量將種子液分別接至含有2% DMSO、2% DMSO和終濃度4 mmol/L茶堿的50 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，24 h后取發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 8.0) 洗滌3次，再用PBS將其懸浮并稀釋一定濃度，取200 μL至96孔板，檢測(cè)600和GFP熒光強(qiáng)度。GFP熒光強(qiáng)度在激發(fā)光495 nm、發(fā)射光525 nm處進(jìn)行檢測(cè)。mCherry的熒光強(qiáng)度在激發(fā)光587 nm、發(fā)射光610 nm處進(jìn)行檢測(cè)。熒光強(qiáng)度以a.u.表示。

1.2.6 普魯蘭酶的表達(dá)及酶活的測(cè)定

將測(cè)序正確的枯草芽胞桿菌進(jìn)行平板劃線(xiàn)，挑取單菌落PBP43EPUL、PBsigWEPUL、PBP43AZPUL、PBrpoBAZPUL于含有卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，再以1%的接種量將種子液分別接至含有2% DMSO、2% DMSO和終濃度4 mmol/L茶堿的50 mL的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，24 h后取樣檢測(cè)600和基因表達(dá)。樣品于12 000 r/min離心5 min分別收集 菌體和上清，將菌體PBS緩沖液洗滌3次，再用含溶菌酶的TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 將其懸浮，在37 ℃下反應(yīng)30 min，并進(jìn)行超聲破碎，離心取上清，獲得酶液。

取50 μL 底物、40 μL緩沖液和10 μL適當(dāng)稀釋酶液混合，65 ℃下反應(yīng)15 min，加入200 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)，煮沸5 min顯色，待冷卻后用蒸餾水補(bǔ)足體積至500 μL，測(cè)定550，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行，每組測(cè)定做適當(dāng)空白。將每分鐘產(chǎn)生與1 μmol葡萄糖相同的還原力所需酶量定義為1 U。

1.2.7 SDS-PAGE

將所取的培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，再用含有1 mg/mL溶菌酶的TE 緩沖液懸浮，37 ℃溫育30 min，超聲破碎適當(dāng)時(shí)間，12 000 r/min離心5 min；取100 μL離心上清，加入25 μL 5×上樣緩沖液，沸水浴10 min。使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行蛋白分離，考馬斯亮藍(lán)R250染色顯示條帶。

In-gel fluorescence[23]：樣品12 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，再用含有1 mg/mL溶菌酶的TE緩沖液懸浮，37 ℃溫育30 min，超聲破碎適當(dāng)時(shí)間，12 000 r/min離心 5 min；取100 μL離心上清，加入25 μL 5×上樣緩沖液。使用不含SDS的蛋白膠進(jìn)行分離，在紫外光下成像，可特異性地顯示目的蛋白，過(guò)濾掉其他不發(fā)光的背景蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組成型啟動(dòng)子匹配茶堿核糖開(kāi)關(guān)后調(diào)控報(bào)告基因GFP表達(dá)的性能

為了深入探討茶堿核糖開(kāi)關(guān)在中對(duì)不同內(nèi)源啟動(dòng)子的兼容程度，本研究從DBTBS庫(kù)中選擇了6種序列明確的內(nèi)源啟動(dòng)子PrpoB[24]、Pylbp[25]、PspoVG[26]、PminC[27]、PsigW[28]、PyqeZ[28]與茶堿核糖開(kāi)關(guān)E融合，轉(zhuǎn)化后構(gòu)建出重組菌PBrpoBEGFP、PBylbpEGFP、PBspoVGEGFP、PBminCEGFP、PBsigWEGFP、PByqeZEGFP。經(jīng)過(guò)4 mmol/L的茶堿處理24 h后，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的GFP熒光強(qiáng)度(F.I/600)，通過(guò)與只經(jīng)過(guò)溶劑DMSO處理的對(duì)照組對(duì)比，檢測(cè)誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)后基因表達(dá)/未誘導(dǎo)基因表達(dá))，作為茶堿核糖開(kāi)關(guān)功能的主要評(píng)價(jià)參數(shù)。結(jié)果如圖3所示，茶堿核糖開(kāi)關(guān)與6種組成型啟動(dòng)子融合均能夠改變組成型表達(dá)特點(diǎn)，與僅用DMSO處理的對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)4 mmol/L的茶堿處理后GFP的表達(dá)強(qiáng)度均有所提高，6株重組菌呈現(xiàn)出不同水平的誘導(dǎo)率。其中核糖開(kāi)關(guān)E與啟動(dòng)子PrpoB匹配構(gòu)成的調(diào)控元件rpoBE介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平最高，處理24 h后達(dá)到(2 047 620±9 570) a.u.，與核糖開(kāi)關(guān)E和啟動(dòng)子P43構(gòu)成的調(diào)控元件P43E[18]相比，基因表達(dá)水平相當(dāng)，但誘導(dǎo)率略低；而sigWE介導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到16.8。

隨后，為了確證GFP熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果，利用SDS-PAGE和In-gel fluorescence法檢測(cè)茶堿處理前后GFP的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過(guò)4 mmol/L茶堿處理24 h后，GFP相對(duì)于未處理的對(duì)照組表達(dá)水平均明顯提升，并且P43E和rpoBE介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平顯著高于其他含有相同核糖開(kāi)關(guān)所介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平，與圖3得到的結(jié)果一致。這一結(jié)果充分表明茶堿核糖開(kāi)關(guān)E能夠與多種來(lái)源的內(nèi)源啟動(dòng)子匹配，匹配后可實(shí)現(xiàn)基因的誘導(dǎo)調(diào)控，但不同啟動(dòng)子與核糖開(kāi)關(guān)E匹配后呈現(xiàn)的調(diào)控性能有差異。

3.1.3患者因素 在X線(xiàn)攝片過(guò)程中，由于患者有外傷，疼痛較重，不能正確配合技術(shù)人員擺位，只能攝取一些被動(dòng)體位?；蛘呤且恍┗颊呱砩嫌胁荒苋∠碌慕饘佼愇锘虿荒苋コ蓛舻母嗨帲瑢?dǎo)致偽影的發(fā)生。還有一些患者不能控制自己的運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)偽影。特別是一些腦外傷合并胸部外傷的患者，他們攝片時(shí)往往處于一種淺而短的呼吸狀態(tài)，這樣胸廓運(yùn)動(dòng)造成偽影使X線(xiàn)片模糊不清[2]。這些都會(huì)使圖像質(zhì)量下降，從而使診斷的正確性降低。

2.2 適體核酶與不同內(nèi)源組成型啟動(dòng)子的適配及調(diào)控功能鑒定

為了構(gòu)建受適體核酶調(diào)控的基因表達(dá)元件，需設(shè)計(jì)茶堿適體域與核酶的融合元件。在此，需要設(shè)計(jì)并篩選適宜于連接茶堿適體域和錘頭狀核酶的通信模塊(CM)。通過(guò)構(gòu)建由3–5 nt隨機(jī)序列構(gòu)成的CM文庫(kù)，系統(tǒng)篩選與此兩個(gè)部分兼容性強(qiáng)的模塊。以質(zhì)粒pP43AZGFP-A為模板，用含隨機(jī)序列的引物SDE1 CM 6N構(gòu)建文庫(kù)。高通量篩選結(jié)果顯示，獲取了含有不同調(diào)控功能的適體核酶(圖5A)，其中選擇含有元件BG8 (5′-GGT···32 nt···TCT-3′)的菌株P(guān)BP43AZGFP作為后續(xù)的研究菌株。將元件BG8在后續(xù)的研究中命名為適體核酶AZ。同時(shí)引入Zhong等[29]使用的WHBS (加權(quán)氫鍵得分) 參數(shù)進(jìn)行分析。在此，利用這一參數(shù)探討枯草芽胞桿菌中通信模塊的結(jié)構(gòu)特征與本底表達(dá)水平之間的相關(guān)性。結(jié)果如圖5B所示，WHBS與本底表達(dá)在0.05水平上顯著相關(guān)，因此可通過(guò)WHBS預(yù)測(cè)含有適體核酶菌株的本底表達(dá)來(lái)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。

圖3 啟動(dòng)子-核糖開(kāi)關(guān)組合調(diào)節(jié)GFP表達(dá)

圖4 SDS-PAGE和In-gel fluorescence檢測(cè)啟動(dòng)子-核糖開(kāi)關(guān)組合調(diào)控GFP表達(dá)

圖5 通信模塊對(duì)適體核酶功能的影響

為了進(jìn)一步探討茶堿適體核酶在中對(duì)不同內(nèi)源啟動(dòng)子的兼容性，本研究選擇與上述相同的6種s內(nèi)源啟動(dòng)子PrpoB、Pylbp、PspoVG、PminC、PsigW、PyqeZ與適體核酶AZ融合，轉(zhuǎn)化后構(gòu)建出重組菌PBrpoBAZGFP、PBylbpAZGFP、PBspoVGAZGFP、PBminCAZGFP、PBsigWAZGFP、PByqeZAZGFP。經(jīng)過(guò)4 mmol/L的茶堿處理24 h后，檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度(F.I/600)，通過(guò)與只經(jīng)過(guò)溶劑DMSO處理的對(duì)照組相比(本底滲漏表達(dá)水平)，計(jì)算誘導(dǎo)率，作為茶堿適體核酶功能的主要評(píng)價(jià)參數(shù)。結(jié)果如圖6所示，與適體核酶適配后，6種組成型啟動(dòng)子均呈現(xiàn)受茶堿激活的調(diào)控特征，與僅用DMSO處理的對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)4 mmol/L的茶堿處理后GFP的表達(dá)強(qiáng)度均有不同程度提高，并呈現(xiàn)出不同水平的誘導(dǎo)率。其中適體核酶AZ與啟動(dòng)子PrpoB匹配構(gòu)成的調(diào)控元件rpoBAZ介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平最高，處理24 h后為 (172 773±2 625) a.u.，且rpoBAZ介導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)的誘導(dǎo)率也最高，達(dá)到6.2。適體核酶AZ與啟動(dòng)子Pylbp匹配構(gòu)成的調(diào)控元 件ylbpAZ介導(dǎo)的GFP的本底表達(dá)水平最低，為 (4 637±1 119) a.u.。

隨后，為了確證GFP熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果，利用SDS-PAGE和In-gel fluorescence法檢測(cè)經(jīng)茶堿處理后GFP的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示，與未處理的對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)4 mmol/L茶堿處理24 h后GFP的表達(dá)水平均顯著提高，且P43AZ和rpoBAZ介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平顯著高于其他啟動(dòng)子-適體核酶元件所介導(dǎo)的GFP表達(dá)水平，與圖6得到的結(jié)果一致。這一結(jié)果表明茶堿適體核酶AZ能夠與多種來(lái)源的內(nèi)源啟動(dòng)子匹配，匹配后可實(shí)現(xiàn)基因的誘導(dǎo)調(diào)控，但不同啟動(dòng)子與適體核酶AZ匹配后呈現(xiàn)的調(diào)控性能有差異。

圖6 啟動(dòng)子-適體核酶組合調(diào)控GFP表達(dá)

圖7 SDS-PAGE和In-gel fluorescence檢測(cè)啟動(dòng)子-適體核酶組合調(diào)控GFP表達(dá)

2.3 核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶調(diào)控mCherry的表達(dá)性能

為了研究核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶對(duì)不同基因的兼容性，分別選取上述研究中表達(dá)調(diào)控元件P43E、sigWE、P43AZ、 rpoBAZ用來(lái)進(jìn)一步分析這些元件的適用性和兼容性，評(píng)價(jià)核糖開(kāi)關(guān)以及人工適體核酶基因表達(dá)元件工作性能。首先，使用mCherry作為檢驗(yàn)蛋白，與上述元件進(jìn)行融合，構(gòu)建菌株P(guān)BP43EmCherry、PBsigWEmCherry、PBP43AZmCherry、PBrpoBAZmCherry。結(jié)果如圖8A所示，P43E介導(dǎo)的mCherry的熒光強(qiáng)度最高，達(dá)到 (128 607±984) a.u.，而sigWE元件介導(dǎo)的mCherry表達(dá)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到9.2。且核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶對(duì)mCherry的調(diào)控在蛋白表達(dá)水平和誘導(dǎo)率水平上與GFP相比趨勢(shì)相似。SDS-PAGE和In-gel fluorescence (圖8B、8C) 結(jié)果顯示，與只經(jīng)過(guò)DMSO處理的對(duì)照組相比，加入4 mmol/L茶堿后，均能啟動(dòng)mCherry的表達(dá)。這一結(jié)果表明茶堿激活型核糖開(kāi)關(guān)與適體核酶能夠與多種來(lái)源的內(nèi)源啟動(dòng)子匹配組合，實(shí)現(xiàn)基因的誘導(dǎo)調(diào)控，并且不同啟動(dòng)子和元件匹配后呈現(xiàn)的調(diào)控效果不同。核糖開(kāi)關(guān)調(diào)控的外源基因激活后表達(dá)水平較適體核酶更高，而適體核酶調(diào)控的基因表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)性較核糖開(kāi)關(guān)更強(qiáng)。

2.4 茶堿核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶調(diào)控元件對(duì)普魯蘭酶的調(diào)控性能

為了擴(kuò)展茶堿調(diào)節(jié)的RNA元件應(yīng)用范圍，檢驗(yàn)元件的可靠性。將普魯蘭酶融合到P43E、sigWE和P43AZ、rpoBAZ的下游，構(gòu)建出菌株P(guān)BP43EPUL、PBsigWEPUL、PBP43AZPUL、PBrpoBAZPUL。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞破碎上清中的酶量和酶活性變化，檢測(cè)這4種元件調(diào)控普魯蘭酶的性能。結(jié)果如圖9所示，核糖開(kāi)關(guān)E與P43啟動(dòng)子匹配構(gòu)成的調(diào)控元件P43E介導(dǎo)的普魯蘭酶的表達(dá)量最高，產(chǎn)酶水平也最高，為 (80.99±2.84) U/mL，誘導(dǎo)率也最高，達(dá)到32.8。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在97.2 kDa下方有一條表達(dá)條帶(圖9A) 為普魯蘭酶目的條帶，其中表達(dá)量最高的是誘導(dǎo)后的PBP43EPUL，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同組合的RNA元件調(diào)控的性能有差異，但是核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶對(duì)于酶的表達(dá)均能實(shí)現(xiàn)調(diào)控，啟動(dòng)子P43介導(dǎo)的RNA元件結(jié)果進(jìn)一步表明，融合同一組成型啟動(dòng)子的條件下，核糖開(kāi)關(guān)誘導(dǎo)后的激活水平較適體核酶更高，適體核酶調(diào)控的嚴(yán)謹(jǐn)性較核糖開(kāi)關(guān)更好。

圖9 啟動(dòng)子-核糖開(kāi)關(guān)組合和啟動(dòng)子-適體核酶組合調(diào)控PUL的表達(dá)

3 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶調(diào)控表達(dá)的枯草芽胞桿菌，并對(duì)它們的性質(zhì)進(jìn)行了分析。核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶對(duì)于不同的啟動(dòng)子均具有調(diào)控功能，且從本底基因表達(dá)、誘導(dǎo)后基因表達(dá)、誘導(dǎo)率的水平綜合評(píng)價(jià)，核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控范圍大，誘導(dǎo)后GFP熒光強(qiáng)度可高至(2 047 620±9 570) a.u.，誘導(dǎo)率最高可至16.8，而適體核酶調(diào)控的嚴(yán)謹(jǐn)性好，本底熒光強(qiáng)度可低至(4 637±1 119) a.u.。

核糖開(kāi)關(guān)和適體核酶均能夠在匹配組成型啟動(dòng)子后被茶堿激活，啟動(dòng)多種外源基因的表達(dá)。兩者介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控性能有所差異。在同一組成型啟動(dòng)子條件下，匹配核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)控元件激活后能夠輸出較高的蛋白表達(dá)水平，而自身同樣具有較高滲漏表達(dá)的特點(diǎn)；匹配適體核酶的元件受茶堿激活前后呈現(xiàn)較低的本底表達(dá)，同時(shí)外源基因表達(dá)水平也相對(duì)較低。核糖開(kāi)關(guān)高表達(dá)、高誘導(dǎo)率的特點(diǎn)可以有效地驅(qū)動(dòng)枯草芽胞桿菌中的基因調(diào)控，而適體核酶低滲漏表達(dá)的特點(diǎn)對(duì)于設(shè)計(jì)枯草芽胞桿菌中更復(fù)雜的遺傳線(xiàn)路具有重要意義。

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Construction and application of theophylline-activated RNA switches in the regulation of expression of recombinant proteins in

Shengnan Miao, Tingyao Yang, Wenjing Cui, and Zhemin Zhou

Key Laboratory of Industrial Biotechnology (MOE), School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

can be widely used as an important microorganism for metabolic engineering and recombinant proteins expression in industrial biotechnology and synthetic biology. However, it is difficult to make accurate regulation of exogenous gene by biological tools in, which limits the application ofin synthetic biology. The purpose of this study is to develop regulatory tools for precise control of gene expression by using non-coding RNAs, by which the activation of heterologous gene could be achieved without the auxiliary protein factors. We constructed the synthetic riboswitch E and aptazyme AZ using the theophylline aptamer. Six different native promoters fromwere functionally adapted with the E and AZ to fabricate an array of novel regulatory elements activated by theophylline. Then, we determined the performance of these elements using green fluorescence protein as reporter, and then further verified using red fluorescence protein and pullulanase as cargo proteins.Results showed that the same kind of RNA elements with different promoters showed different levels of efficiency. Promoter PsigWand E combination (sigWE) had the highest induction rate in. Compared with the control group, it can produce the induction rate of 16.8. Promoter PrpoBand AZ combination (rpoBAZ) showed the highest induction rate of 6.2. SigWE mediated mCherry induction rate was 9.2, and P43E mediated pullulanase induction rate was 32.8, in which enzyme activity reached 81 U/mL. This study confirmed that GFP, mCherry and pullulan can all be regulated by riboswitch and aptazyme, but there were differences between different combinations of promoters with RNA regulators.

riboswitch, aptazyme,, gene regulation

January 21, 2019;

March 19, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21878125).

Zhemin Zhou. Tel: +86-510-85325210; Fax: +86-510-85197551; E-mail: zhmzhou@jiangnan.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21878125) 資助。

繆勝男, 楊婷堯, 崔文璟, 等. 茶堿激活型RNA分子開(kāi)關(guān)的構(gòu)建及在枯草芽胞桿菌中調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的性能. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1478–1490.Miao SN, Yang TY, Cui WJ, et al. Construction and application of theophylline-activated RNA switches in the regulation of expression of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1478–1490.

(本文責(zé)編 陳宏宇)