陳斌，田娟，馮志迪，王歡，李梅蘭，孔照勝

大麗輪枝菌微絲熒光標(biāo)記載體構(gòu)建及應(yīng)用

陳斌1,2，田娟2，馮志迪2，王歡2，李梅蘭1，孔照勝1,2

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801 2 中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101

微絲在真菌生長發(fā)育、胞質(zhì)分裂等生命過程中具有重要功能。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法，將熒光mCherry標(biāo)記微絲的表達載體pSULPH-Lifeact-mCherry轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌(Kleb.) 野生型V592，獲得穩(wěn)定的微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry，并檢測了其生物學(xué)表型和孢子萌發(fā)、菌絲生長等過程中的微絲熒光動態(tài)變化。結(jié)果表明：微絲熒光標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)、生長速率、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率等表型與野生型沒有顯著差異；且可以觀察到微絲熒光信號在分生孢子和菌絲的頂端及隔膜都有清晰定位，同時對該菌株隔膜形成過程微絲動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，微絲參與胞質(zhì)分裂進程中肌動球蛋白收縮環(huán)CAR (Contractile actomyosin ring) 的形成。微絲熒光標(biāo)記菌株可用于微絲在真菌發(fā)育中的動力學(xué)研究，這為深入研究微絲在真菌發(fā)育及致病過程中的作用機制提供理論與實踐支撐。

大麗輪枝菌，微絲標(biāo)記，生長發(fā)育，隔膜，頂端生長

大麗輪枝菌 (Kleb.) 是一種土傳維管束病原真菌，它嚴(yán)重影響包括棉花spp.、茄子L.和萵苣L.等在內(nèi)的38科660余種栽培作物和野生植物的生長[1-3]。侵染循環(huán)起始于菌絲生長接觸并吸附植物根表面，菌絲形成特異侵染結(jié)構(gòu)附著枝進而形成侵染釘刺穿根部表皮[4-5]。菌絲和分生孢子隨后在植物的維管組織中定殖，造成維管組織系統(tǒng)褐變，最終導(dǎo)致植物死亡[6-8]。該病原菌具有致病力強、寄主廣、生理小種多等特征，而且微菌核可不依賴于寄主在土壤中存活14年之久[9]，發(fā)病后很難高效地控制病情蔓延而導(dǎo)致欠收甚至絕收，故對致病機制深入研究進而有效防治黃萎病已成為當(dāng)前植物病害防控領(lǐng)域的研究熱點。

細胞骨架微絲對絲狀真菌生命活動的正常進行至關(guān)重要，包括菌絲頂端極性生長[10]、細胞分裂[11]、胞吞作用[12]和生物大分子的運輸[13-14]等。其中絲狀真菌頂端生長進程中囊泡可沿著微絲移動至頂體，繼而被肌球蛋白沿微絲輸送至頂端質(zhì)膜[10]；模式絲狀真菌構(gòu)巢曲霉隔膜形成過程中微絲與Ⅱ型肌球蛋白MyoB共定位，且微絲解聚后胞質(zhì)分裂中肌動球蛋白收縮環(huán) (Contractile actomyosin ring，CAR) 收縮和MyoB的定位均被阻斷[15]。熒光蛋白標(biāo)記微絲已成為研究細胞骨架結(jié)構(gòu)及動態(tài)的常見細胞生物學(xué)方法[16-17]。Lifeact只有17個氨基酸大小，可與微絲穩(wěn)定結(jié)合且不影響微絲動態(tài)[18]。mCherry紅色熒光蛋白具有較高熒光信噪比，可用于目的蛋白定位、實時追蹤以及基因表達等研究[19-22]。因此，Lifeact-mCherry熒光蛋白可作為真核生物廣泛存在的微絲骨架及其互作細胞組分的示蹤標(biāo)記物。

真菌微絲在其胞質(zhì)分裂、菌絲頂端生長、菌絲形態(tài)建成及定殖宿主等生命活動中具有非常重要的功能[23]。然而微絲在其生長發(fā)育及與宿主互作中的作用機制還不是很清楚。本研究中，我們利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法獲得微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry，且可以穩(wěn)定清晰地觀察其發(fā)育進程中微絲動態(tài)，這為發(fā)育機理、與環(huán)境互作機制及微絲互作蛋白篩選等方面的深入研究奠定了較好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

野生型V592、農(nóng)桿菌AGL1菌株、質(zhì)粒pentry-Lifeact-mCherry和pSULPH-mut-RG# PB均由本實驗室保存，感受態(tài)大腸桿菌Trans10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基

Gene Ruler DNA Ladder Mix、CloneExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit、2×PCR Master Mix、限制性內(nèi)切酶RⅠ和HⅠ、PCR產(chǎn)物純化和DNA膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒 (離心柱型)。培養(yǎng)于查氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基；大腸桿菌和農(nóng)桿菌分別培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基和YEP培養(yǎng)基。所用硫酸卡那霉素(Kanamycin，Kan)的濃度為50 μg/mL，利福平(Rifampicin，Rif)的濃度為25 μg/mL[24]。

1.2 方法

1.2.1 微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry的獲得

以Lifeact-mCherry-F/Lifeact-mCherry-R從質(zhì)粒pentry-Lifeact-mCherry中PCR擴增目的基因片段 (引物見表1，在5′端和3′端分別引入HⅠ和RⅠ酶切位點，在插入片段正反向引物的 5′端各引入約15 bp的線性化載體兩末端同源序列)；質(zhì)粒載體pSULPH-mut-RG#PB使用限制性內(nèi)切酶HⅠ和RⅠ進行雙酶切線性化后，用One Step Cloning Kit將克隆所得的目的基因片段連入表達載體；菌落PCR鑒定為陽性克隆的菌落，提質(zhì)粒酶切鑒定或測序進一步確認(rèn)。電擊轉(zhuǎn)化法將連有目的片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中，取陽性克隆進行培養(yǎng)；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(-mediated transformation，ATMT)方法將pSULPH-Lifeact- mCherry微絲標(biāo)記表達載體轉(zhuǎn)入野生型V592，單孢分離后經(jīng)抗生素篩選獲得微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry。

1.2.2 微絲熒光標(biāo)記菌株表型鑒定

菌株生長速率測定：將野生型菌株V592和微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，用打孔器取0.5 cm菌塊放置于新的PDA培養(yǎng)基的中央，26 ℃黑暗培養(yǎng)，每3 d測量一次菌落橫縱直徑并計算平均值。每個菌株均重復(fù)6次。

菌株產(chǎn)孢量統(tǒng)計：將V592和V592/Lifeact- mCherry接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，打孔器在各自菌株的菌落邊緣同一位置取0.5 cm的菌塊置于1 mL無菌雙蒸水中，迅速振蕩使分生孢子從培養(yǎng)基上洗脫下來并均勻分布于無菌水中，用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子濃度。每個菌株均重復(fù)6次。

菌株萌發(fā)率統(tǒng)計：用液體查氏培養(yǎng)基將不同類型菌株的分生孢子從PDA培養(yǎng)基上洗脫下來，利用血球計數(shù)板調(diào)整分生孢子濃度至106孢子/mL左右，將孢子懸浮液滴于載玻片上，26 ℃培養(yǎng)12 h統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)情況。每個菌株均重復(fù) 6次。

1.2.3 微絲熒光標(biāo)記菌株的分生孢子與營養(yǎng)生長菌絲中微絲熒光信號觀察

用液體查氏培養(yǎng)基將分生孢子從PDA培養(yǎng)基洗脫下來并稀釋至106孢子/mL；取10 μL孢子液滴于載玻片，蓋上蓋玻片，四周封口，然后激光共聚焦顯微鏡觀察孢子中微絲定位情況；取20 μL孢子液滴于培養(yǎng)皿中央，蓋上培養(yǎng)皿，封口，置于26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱里保濕培養(yǎng)一定時間后觀察菌絲中微絲分布情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

GraphPad Prism7、Image J軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析與作圖。

表1 文中所用引物列表

The underlined line sequences indicate restriction enzyme site and the wavy line indicate the homologous sequence on the vector.

2 結(jié)果與分析

2.1 V. dahliae微絲熒光標(biāo)記菌株V592/ Lifeact-mCherry的獲得

以質(zhì)粒pentry-Lifeact-mCherry為模板PCR擴增出最終帶有HⅠ和RⅠ的酶切位點的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示基因編碼序列和酶切位點全長為816 bp，說明基因克隆成功。pSULPH-mut-RG#PB載體質(zhì)粒進行雙酶切后用ExnaseⅡ酶進行一步法連接，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后菌落PCR驗證陽性克隆，進一步測序驗證。重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1，抗生素篩選獲得陽性單克隆。農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA隨機插入法將基因片段插入基因組，單孢分離后經(jīng)抗生素篩選獲得微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry。

2.2 微絲熒光標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)和生長速率與野生型V592相近

如圖1A所示，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)16 d的微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry和野生型菌株V592的菌落形態(tài)無明顯差異，都有發(fā)達的白色氣生菌絲和致密的黑色微菌核。從圖1B可看出，微絲熒光標(biāo)記菌株的菌落生長速率與野生型菌株相似；微絲熒光標(biāo)記菌株最終直徑約為8.23 cm，而野生型菌落最終直徑約為8.17 cm，二者之間無顯著差異 (>0.05)。綜上，我們認(rèn)為微絲熒光標(biāo)記菌株在PDA培養(yǎng)基的菌落形態(tài)和生長速率與野生型菌株相近。

2.3 微絲熒光標(biāo)記菌株產(chǎn)孢量、萌發(fā)率都與野生型V592無差異

對微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry和野生型菌株V592產(chǎn)孢量和萌發(fā)率進行了統(tǒng)計。如圖2A所示，微絲熒光標(biāo)記菌株產(chǎn)孢量約為 (3.73±0.58)×106孢子/mL，約相當(dāng)于野生型的91.60%，檢驗對二者產(chǎn)孢量進行差異分析，說明微絲熒光標(biāo)記菌株和野生型菌株的產(chǎn)孢量沒有顯著差異 (>0.05)。如圖2B所示，微絲熒光標(biāo)記菌株萌發(fā)率約為93.86%，約為野生型的97.90%，檢驗對二者萌發(fā)率進行差異分析，說明微絲熒光標(biāo)記菌株和野生型菌株的萌發(fā)率也沒有顯著差異 (>0.05)。綜合以上結(jié)果表明微絲熒光標(biāo)記菌株產(chǎn)孢量、萌發(fā)率都與野生型V592無差異。

2.4 微絲熒光標(biāo)記菌株分生孢子和營養(yǎng)菌絲中的微絲分布

細胞骨架微絲即肌動蛋白絲參與真菌頂端生長、胞質(zhì)分裂、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)燃毎顒?。為探究中微絲分布情況，我們用激光共聚焦顯微鏡觀察了微絲熒光標(biāo)記菌株發(fā)育過程中微絲的亞細胞定位。如圖3所示，分生孢子中微絲主要以點狀分布于將要萌發(fā)的孢子頂端細胞活動旺盛區(qū)域。如圖4所示，營養(yǎng)菌絲生長過程中微絲主要沿菌絲生長方向分布于菌絲細胞兩側(cè)內(nèi)壁，且在頂端有聚集現(xiàn)象，或 呈環(huán)狀分布于正在形成的隔膜。從圖5可看出，菌絲胞質(zhì)分裂過程中微絲從菌絲細胞膜內(nèi)側(cè)兩端不斷聚合從而參與肌動球蛋白收縮環(huán)的組裝；接著環(huán)開始漸漸收縮并在第6 min時微絲相對熒光強度達到峰值，繼而環(huán)逐漸降解熒光強度也隨著下降，整個過程約持續(xù)14 min。

圖1 野生型與微絲熒光標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)與生長特性

圖2 野生型與微絲熒光標(biāo)記菌株的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率

圖3 微絲熒光標(biāo)記菌株孢子中微絲的亞細胞定位

圖4 微絲熒光標(biāo)記菌株菌絲中微絲的亞細胞定位

圖5 微絲熒光標(biāo)記菌株菌絲隔膜形成過程中微絲動態(tài)及微絲相對熒光強度

3 討論

是棉花等眾多重要雙子葉植物最具威脅的病原之一，所以的生長發(fā)育及致病機制一直是研究熱點。真菌微絲在維持菌絲頂端極性生長、胞質(zhì)分裂、胞吞及與宿主互作等一系列細胞活動中具有重要的生物學(xué)功能[13, 25]。鬼筆環(huán)肽微絲染色法具有操作復(fù)雜、毒性較大、抑制微絲功能等局限，因此我們構(gòu)建微絲標(biāo)記表達載體pSULPH-Lifeact-mCherry，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化野生型V592獲得穩(wěn)定的微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact-mCherry。標(biāo)記菌株的菌落形態(tài)、生長速率、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率等表型與野生型V592沒有顯著差異 (圖1和圖2)。因此，微絲熒光標(biāo)記菌株可以用來觀察生長發(fā)育中微絲動態(tài)。此外，使用激光共聚焦顯微鏡觀察了微絲在分生孢子和營養(yǎng)菌絲中的分布情況。

微絲骨架對菌絲頂端極性建立與維持是必要的。肌動蛋白及其結(jié)合蛋白如冠蛋白等和肌動蛋白馬達蛋白肌球蛋白對真菌頂端生長至關(guān)重要，肌動蛋白、冠蛋白、絲束蛋白、Arp2/3 (Actin-relatedprotein 2/3，Arp2/3) 復(fù)合物等共同組成內(nèi)吞頸圈[26]，構(gòu)巢曲霉 ()Ⅰ型肌球蛋白MYOA在芽管頂端與肌動蛋白共定位，且在菌絲極性生長與分泌中起關(guān)鍵作用[27]；而Ⅴ型肌球蛋白MyoE在頂體的定位依賴于微絲，且對菌絲形態(tài)起重要作用[28]；且Ⅴ型幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthase with a myosin motor-like domain，CsmA)通過MMD (Myosin motor-like domain，MMD) 結(jié)構(gòu)域與微絲直接相互作用，參與絲狀真菌極性生長過程細胞壁合成和菌絲形態(tài)建成[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)中微絲主要以點狀分布于將萌發(fā)狀態(tài)孢子頂端或菌絲頂端的細胞活動旺盛區(qū)域 (圖3和4)。這可能與細胞頂端極性生長過程中活躍的微絲動態(tài)重構(gòu)有關(guān)，菌絲頂端生長涉及的內(nèi)吞作用和細胞壁合成相關(guān)的酶等物質(zhì)的極性運輸兩大過程中都離不開微絲的參與。

胞質(zhì)分裂對絕大多數(shù)生物生存都極其重要，它需要細胞信號、細胞外基質(zhì)重構(gòu)等活動協(xié)調(diào)作用，出芽酵母細胞分裂過程包括CAR的組裝、收縮和解體、隔膜的形成、脫落及其時空協(xié)調(diào)[30]。肌動蛋白是肌動球蛋白收縮環(huán)組裝與維持所必需，在胞質(zhì)分裂過程中起關(guān)鍵作用[31-34]。研究表明，裂殖酵母肌動蛋白絲和Ⅱ型肌球蛋白是胞質(zhì)分裂中收縮環(huán)動力來源的保守組分[31]；中肌動蛋白絲從胞質(zhì)分裂節(jié)點開始延伸并且形成束進而形成收縮環(huán)，收縮環(huán)收縮與隔膜形成同步[32]。胞質(zhì)分裂時肌動球蛋白環(huán)的收縮主要由肌動蛋白解聚驅(qū)動[11]，肌動蛋白在芽頸處與Ⅱ型肌球蛋白結(jié)合形成CAR，然后再進行胞質(zhì)分裂，CAR收縮同時開始形成初級隔膜，隨后質(zhì)膜向頸部內(nèi)陷，CAR收縮依賴于微絲[33-34]。

絲狀真菌菌絲中胞質(zhì)分裂與酵母不同，它們不涉及母細胞與子細胞的分離，只是在菌絲中形成隔膜從而維持適當(dāng)?shù)募毎w表面積比，但微絲在胞質(zhì)分裂CAR組裝、維持、收縮等過程中的功能相對保守[15,23,31-32,35]。模式絲狀真菌稻瘟菌中CAR首先從菌絲兩側(cè)的細胞壁隔膜起始位點開始組裝，隨著隔膜的形成，收縮環(huán)慢慢向中心聚集，隔膜完全形成后環(huán)會在隔膜中心部位形成一個亮點，之后漸漸解體消失[36]。同樣，禾谷鐮孢菌、粗糙脈孢菌胞質(zhì)分裂CAR的動態(tài)過程也類似[35, 37]。胞質(zhì)分裂是真菌增殖和分化等重要生命活動進程的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)生長菌絲中微絲主要沿菌絲生長方向分布于菌絲細胞兩側(cè)內(nèi)壁；或呈環(huán)狀分布于正在形成中的菌絲隔膜 (圖4)。我們對菌絲胞質(zhì)分裂中微絲動力學(xué)進行分析發(fā)現(xiàn)，微絲先分布于菌絲細胞膜內(nèi)側(cè)兩端；接著不斷聚合且與其他相關(guān)蛋白組裝成肌動球蛋白收縮環(huán)；之后環(huán)開始收縮逐漸加粗，且持續(xù)一段時間，最后慢慢降解消失 (圖5)。這與Guo等和Song等的研究結(jié)論基本一致[36-37]。說明菌絲胞質(zhì)分裂過程中微絲參與組裝肌動球蛋白收縮環(huán)，從而為隔膜形成提供動力和軌道。

微絲熒光標(biāo)記菌株V592/Lifeact- mCherry菌落形態(tài)、生長速率、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率等表型與野生型V592沒有顯著差異，且可以穩(wěn)定清晰地觀察其生長發(fā)育進程中的微絲動態(tài)變化，這為深入研究其發(fā)育機理及致病機制提供理論與實踐基礎(chǔ)。

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Construction and application of actin fluorescent marker inKleb.

Bin Chen1,2, Juan Tian2, Zhidi Feng2, Huan Wang2, Meilan Li1, and Zhaosheng Kong1,2

1 College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China 2 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Actin filaments play an important role in fungal life processes such as growth, development and cytokinesis. The expression vector pSULPH-Lifeact-mCherry of fluorescent mCherry-labeled actin was transferred intoKleb. wild type V592 by the genetic transformation system mediated byto obtain the stable fluorescent labeled actin strain V592/Lifeact-mCherry. Then we detected its biological phenotype and the dynamic changes of actin fluorescence during the process of spore germination, mycelial growth and development. There was no significant difference in the colony morphology, colonial growth rate, sporulation and germination rate between the fluorescent labeled actin strain and the wild type. The actin fluorescence signal was observed at the tip of the conidia and hyphae and the septum clearly. Actin participated in the formation of the contractile actomyosin ring (CAR) during cytokinesis by observing the dynamic behavior of the actin in the process of hyphal septum formation. The fluorescent labeled actin strain can be used to study the dynamics of actin in fungal development to provide theoretical and practical support for further study of the mechanism of actin in fungal development and pathogenesis.

, actin marker, growth and development, septum, tip-growth

May 10, 2019;

June 3, 2019

Supported by:National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFD0200600), Shanxi Province Key Research and Development Program Key Projects (No. 201703D211001-04-01).

Zhaosheng Kong. Tel/Fax: +86-10-64806099; E-mail: zskong@im.ac.cn

Meilan Li. Tel/Fax: +86-354-6288771; E-mail: 15935485975@163.com

國家重點研發(fā)計劃項目 (No. 2017YFD0200600)，山西省重點研發(fā)計劃重點項目(No. 201703D211001-04-01) 資助。

2019-06-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190610.1120.003.html

陳斌, 田娟, 馮志迪, 等. 大麗輪枝菌微絲熒光標(biāo)記載體構(gòu)建及應(yīng)用.生物工程學(xué)報, 2019, 35(8): 1520–1528.Chen B, Tian J, Feng ZD, et al. Construction and application of actin fluorescent marker in Verticillium dahliae Kleb. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1520–1528.

(本文責(zé)編 陳宏宇)