郭敏，趙子雅，王瑞寧，鄭曉寧，彭永東，劉錚鑄，李祥龍，鞏元芳

北極狐β-防御素103基因()啟動子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析

郭敏1，趙子雅1，王瑞寧1，鄭曉寧2，彭永東1，劉錚鑄1，李祥龍1，鞏元芳1

1 河北科技師范學院 動物科技學院，河北 秦皇島 066004 2 河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000

本研究旨在篩選調(diào)控北極狐毛色基因的啟動子活性區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，為揭示基因調(diào)控北極狐毛色形成的分子遺傳機制提供依據(jù)。克隆獲得了北極狐基因5′側(cè)翼區(qū)2 123 bp的片段，并構(gòu)建了4個不同長度的啟動子缺失片段表達載體，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對啟動子活性進行檢測。對啟動子活性最高區(qū)域預(yù)測出的3個特異性蛋白1 (Sp1) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分別進行點突變并構(gòu)建3個突變載體，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測定其活性。結(jié)果顯示，在構(gòu)建的4個不同長度啟動子缺失片段中1 656 (?1 604/+51) 區(qū)域活性最高，在此區(qū)域構(gòu)建的3個突變載體的啟動子活性較野生型 (片段1 656) 均顯著降低，說明?1 604/+51區(qū)域為北極狐基因的核心啟動子區(qū)，?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339區(qū)域為正調(diào)控區(qū)域。文中成功獲得了北極狐基因的核心啟動子區(qū)域和正調(diào)控區(qū)域，這為進一步研究該基因調(diào)控北極狐被毛顏色分子遺傳機制奠定了基礎(chǔ)。

北極狐，基因，啟動子活性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

多彩的毛皮不僅是動物在自然選擇下所遺留的成果，更為動物界增添了靚麗。毛色作為一種重要的表型遺傳標記，在確定品種純度、親緣關(guān)系等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時對毛皮品質(zhì)也有著重要的影響[1-2]。黑色素是位于動物表層結(jié)構(gòu)中最重要的色素[3-4]。防御素 (Defensins) 是一種陽離子抗菌肽，根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)的不同可分為α、β和θ防御素[5]；其中β-防御素103基因主要在哺乳動物上皮組織中表達，其編碼的防御素是富含精氨酸殘基的分泌型多肽。哺乳動物基因通常含有1個內(nèi)含子和2個外顯子，第一個外顯子編碼5′端非編碼序列、信號序列和部分前導(dǎo)序列，第二個外顯子編碼剩余前導(dǎo)序列、3′端非編碼序列以及成熟肽[6]?；蛟谝恍┎溉閯游锩愋娃D(zhuǎn)換的相關(guān)研究中表現(xiàn)出重要作用，該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)相似，其蛋白產(chǎn)物競爭性結(jié)合MC1R且親和力極高，可改變黑色素合成通路，最終改變動物的毛色[7]。這一結(jié)果拓展了對β-防御素作用的認識，其不僅對哺乳動物具有免疫作用[8]，還可通過黑皮質(zhì)素受體信號最終改變動物毛色，成為毛色調(diào)控的候選基因。在基因表達調(diào)控過程中起“總指揮”作用的啟動子具有決定轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控基因表達的功能[9]。目前尚未見北極狐基因調(diào)控毛色的報道。本研究利用先進的分子生物學技術(shù)結(jié)合生物信息學分析[10-11]等方法對基因啟動子區(qū)及調(diào)控元件進行預(yù)測及分析，探明該基因的核心啟動子區(qū)域及重要的調(diào)控元件，為深入探究該基因?qū)Ρ睒O狐毛色形成的調(diào)控作用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北極狐皮膚組織樣品取自河北省秦皇島市昌黎縣金島育種場。LADNA Polymerase、pMD19-T Vector、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa公司；2×TransStart FastPCR SuperMix和TransStartDNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒、胰蛋白酶、限制性內(nèi)切酶、血清、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Thermo Fisher Scientific公司 (美國)；質(zhì)粒DNA小量提取抽提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；D-PBS和DMEM培養(yǎng)基 (高糖型) 購自Hyclone公司 (美國)[12]。本實驗室保藏有人惡性黑色素瘤細胞系 (A375)、人腎上皮細胞系 (293T)、質(zhì)粒載體pRL-TK和pGL3-Basic。

1.2 北極狐CBD103基因啟動子的克隆擴增

課題組前期擴增獲得北極狐基因序列2 327 bp (包括5′側(cè)翼區(qū)2 071 bp、CDS區(qū) 204 bp、3′側(cè)翼區(qū)52 bp)，并利用生物信息學的方法對啟動子區(qū)及調(diào)控元件進行了預(yù)測[13]。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，選取起始密碼子上游2 000 bp左右的序列作為候選啟動子區(qū)并設(shè)計引物 (表1)，PCR擴增4個缺失片段 (圖1)。。使用Primer Premier 5.0分析限制性內(nèi)切酶位點。PCR擴增體系 (50 μL)：其中基因組DNA 1 μL，10×PCR緩沖液 (Mg2+Plus) 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 8 μL，上游引物 (20 μmol/L) 1 μL，下游引物 (20 μmol/L) 1 μL，LADNA聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL。使用JASPAR、AliBaba 2.1、Nsite、Cluster和Signal SCAN在線網(wǎng)站預(yù)測啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (表2)。

表1 本文中使用的引物

Note: the underlined and thickened bases represent restriction sites and mutant bases, respectively.

圖1 北極狐CBD103基因預(yù)測啟動子片段

1.3 構(gòu)建及鑒定缺失片段報告載體

將不同缺失片段的PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體中構(gòu)建重組克隆載體pMD19-X。經(jīng)過菌液PCR鑒定為陽性的樣品送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。重組克隆載體pMD19-X及pGL3-Baisc載體同時進行雙酶切，將回收產(chǎn)物連接至pGL3-Baisc中構(gòu)建pGL3-Baisc-X重組報告載體。

1.4 構(gòu)建及鑒定突變載體

分別以1656F和Mut-Sp1-1-R、Mut-Sp1-1-F和R、1656F和Mut-Sp1-2-R、Mut-Sp1-2-F和R、1656F和Mut-Sp1-3-R、Mut-Sp1-3-F和R為引物 (表1)，以pGL3-Baisc-1656質(zhì)粒為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)擴增上下游產(chǎn)物。重疊延伸PCR擴增體系 (40 μL)：野生型質(zhì)粒模板2 μL，2×Super Mix 20 μL，上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μL，滅菌ddH2O 16 μL；將上述擴增的產(chǎn)物進行回收并進行等比例混合，用此混合物為模板，以引物1656F和R擴增突變載體全長片段，PCR擴增體系 (50 μL)：其中混合物模板2.5 μL，10×TransStart緩沖液 5 μL，TransStartDNA聚合酶0.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 1 μL，上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μL，滅菌ddH2O 39 μL。

1.5 雙熒光素酶活性鑒定

利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體分別將熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-Baisc-X和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK一起轉(zhuǎn)染至293T和A375細胞中，轉(zhuǎn)染細胞48 h后收集細胞，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書對基因啟動子活性進行檢測。使用發(fā)光儀檢測pGL3質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶活性，讀出數(shù)值為F，檢測pRL-TK質(zhì)粒中海腎熒光素酶活性，讀出數(shù)值為R。用F/R的值代表基因啟動子相對活性。

1.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 24.0軟件中的單因素方差分析對不同檢測片段的啟動子活性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，<0.05表示差異顯著性，<0.01表示差異極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 北極狐CBD103基因啟動子缺失載體的擴增

以基因組DNA為模板，對北極狐基因候選啟動子區(qū)域進行不同缺失片段的擴增，分別擴增出片段1?4∶2 123 bp (?2 017/+51)、1 656 bp (?1 604/+51)、1 178 bp (?1 126/+51) 和559 bp (?507/+51)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2，擴增出的條帶大小與預(yù)期相一致。

表2 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站

圖2 北極狐CBD103基因啟動子缺失片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.2 北極狐CBD103基因啟動子熒光素酶表達載體的構(gòu)建

使用T4 DNA連接酶將雙酶切后的片段連接到pGL3-Basic質(zhì)粒上，將構(gòu)建完成的熒光素酶表達載體進行鑒定 (圖3和圖4)。

2.3 北極狐CBD103基因5′端序列的活性分析

將啟動子熒光素酶表達載體質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至A375和293T細胞中，檢測雙熒光素酶活性 (圖5)，結(jié)果顯示4個啟動子缺失片段熒光素酶表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種細胞的活性值高低趨勢一致；除報告基因2 123 (–2 071/+51) 與pGL3-basic對照組相比差異顯著 (0.05) 外，其他3個啟動子片段的活性與對照組比較均差異極顯著 (0.01)；報告基因1 656 (?1 604/+51) 在兩種細胞間的活性均最高，且與其他3個片段活性相比，均差異極顯著 (0.01)，表明該區(qū)域為該基因的核心啟動子區(qū)域。

圖3 北極狐CBD103基因熒光素酶表達載體PCR產(chǎn)物凝膠電泳

圖4 北極狐CBD103基因熒光素酶表達載體雙酶切產(chǎn)物凝膠電泳

圖5 北極狐CBD103基因啟動子表達載體相對熒光素酶活性值

2.4 北極狐CBD103基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

利用多種轉(zhuǎn)錄因子在線分析網(wǎng)站對核心啟動子區(qū) (?1 604/+51) 的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測，為了提高預(yù)測的準確性，綜合考慮至少2個預(yù)測網(wǎng)站的結(jié)果 (表3)，分析結(jié)果表明在?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339位置存在Sp1結(jié)合位點。

2.5 北極狐CBD103基因核心啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點Sp1突變體活性分析

以pGL3-Baisc-1656為模板對預(yù)測的3個Sp1結(jié)合位點分別進行點突變 (圖6)，通過重疊延伸PCR技術(shù)擴增上下游引物并構(gòu)建突變載體 (圖7)，突變前后序列對比見表4，分別將pGL3-Baisc-1656載體和突變載體轉(zhuǎn)染至A375和293T細胞中，并對啟動子活性進行檢測，結(jié)果表明，相比于野生型載體1656 (?1 604/+51)，3個Sp1結(jié)合位點突變后的載體啟動子活性均極顯著下降 (0.01) (圖8)。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

圖6 北極狐CBD103基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變

圖7 北極狐CBD103基因啟動子突變體的擴增

表4 北極狐CBD103基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變前后比較

Note: the underlined and thickened bases represent mutant bases.

圖8 北極狐CBD103基因突變啟動子表達載體相對熒光素酶活性值

3 討論

狐皮被稱為世界毛皮產(chǎn)業(yè)三大臺柱之一，其毛色性狀[14]將直接影響皮張品質(zhì)和其經(jīng)濟價值。動物毛色的形成主要受遺傳因素控制，基因調(diào)控動物毛色形成的機理十分復(fù)雜[15]。啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，就像“開關(guān)”決定基因的活動，其克隆方式也越來越多，大致分為基因組文庫篩選法、利用啟動子探針載體篩選啟動子法和基于PCR技術(shù)克隆啟動子法等，這些技術(shù)在生物實驗中得到了不同程度的應(yīng)用[16]。研究表明克隆片段若僅含有轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可選擇包含TSS、ATG及部分CDS區(qū)來提高陽性率[17]。本研究克隆獲得了北極狐基因啟動子序列，構(gòu)建了4個不同長度的啟動子缺失片段表達載體，通過雙熒光素酶系統(tǒng)檢測啟動子活性，以確定啟動子的功能序列位置。經(jīng)檢測確定?1 604/+51區(qū)域為北極狐基因的核心啟動子區(qū)，同時對此區(qū)域的調(diào)控元件進行預(yù)測，結(jié)果顯示該區(qū)域存在3個Sp1 (?329/?339；?1 439/?1 454；?1 552/?1 564) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。現(xiàn)已在壩上長尾雞基因[18]，北極狐、水貂基因[19-20]，壩上長尾雞、北極狐、山羊、水貂基因[21-24]中的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)存在Sp1這一轉(zhuǎn)錄因子。Sp1已被證實是一種能影響轉(zhuǎn)錄起始的反式激活子[25]。啟動子中存在多種順式作用元件參與基因的轉(zhuǎn)錄，如CAAT框、TATA框和GC框等。CAAT框是真核生物基因中普遍存在的調(diào)控區(qū)，控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率[26]；TATA決定基因轉(zhuǎn)錄起始的選擇，并能影響轉(zhuǎn)錄的速率；GC框主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點前?128/?23 bp區(qū)域內(nèi)，一般位于CAAT框的兩側(cè)和TATA框上游，能夠結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白Sp1[27]。有學者指出，某基因中CAAT框若存在于TATA框上游，則該基因的表達量將出現(xiàn)大幅提升[28]。對北極狐基因啟動子區(qū)調(diào)控元件進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因在同一區(qū)域存在GC框 (?1 560) 和Sp1 (?1 552/?1 564) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，推測GC框可能與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，為北極狐基因核心啟動子區(qū)的確定提供參考。研究發(fā)現(xiàn)Sp1的抑制表達能夠顯著降低豬成肌細胞中啟動子活性，Sp1通過GC框?qū)ωi成肌細胞分化過程中基因的轉(zhuǎn)錄激活起正調(diào)控作用[29]。田宏攀[30]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Sp1對基因啟動子轉(zhuǎn)錄激活的控制受到DNA甲基化的影響，Sp1可以增強無甲基化和部分甲基化的基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性，對完全甲基化的啟動子轉(zhuǎn)錄活性無影響。3個Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的突變 (?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339) 都能夠使得北極狐基因啟動子的活性顯著下降，推斷以上3個Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點為北極狐基因的正調(diào)控區(qū)域。為了進一步探究轉(zhuǎn)錄因子Sp1與北極狐基因之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，接下來可利用染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP) 和凝膠遷移實驗 (EMSA) 進行驗證，并與其他毛色調(diào)控基因啟動子序列中的轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的具體作用做對比以發(fā)現(xiàn)這其間的共性，為進一步探究動物毛色的調(diào)控機制做鋪墊。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了4個包含北極狐基因5′端不同長度缺失啟動子片段的熒光素酶報告基因表達載體，確定了?1 604/+51區(qū)域為北極狐基因的啟動子區(qū)；通過生物信息學方法預(yù)測出?1 552/?1 564、?1 439/?1 454和?329/?339處存在Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并對以上3個結(jié)合位點進行點突變和活性檢測，結(jié)果顯示以上3個轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點為北極狐基因的正調(diào)控區(qū)域。

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Activity and transcriptional regulatory elements of the promoter in Arctic fox () β-defensin103 gene

Min Guo1, Ziya Zhao1, Ruining Wang1, Xiaoning Zheng2, Yongdong Peng1, Zhengzhu Liu1, Xianglong Li1, and Yuanfang Gong1

1 College of Animal Science and Technology,Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei, China 2 College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei Province,Baoding 071000, Hebei, China

The aim of this study was to screen the active regions and transcription factor binding sites in the promoter of thegene related to Arctic fox coat color, and to provide a basis for revealing the molecular genetic mechanism ofgene regulating the coat color formation. The 5′-flanking region fragment 2 123 bp of Arctic foxgene was cloned, and 4 truncated promoter reporter vectors of different lengths were constructed. The promoter activity was detected by the dual-luciferase reporter assay system. Point mutations were performed on the 3 predicted specificity protein 1 (Sp1) transcription factor binding sites in the highest promoter active region, and 3 mutant vectors were constructed. The activity was then detected by the dual-luciferase reporter assay system. The results showed that the region 1 656 (?1 604/+51) had the highest activity in the 4 truncated promoters of different lengths, and the promoter activity of the three mutant vectors constructed in this region were significantly lower than that of the wild type (fragment 1 656). The region of ?1 604 /+51 was the core promoter region ofgene in Arctic fox and ?1 552/?1 564, ?1 439/?1 454 and ?329/?339 regions were positive regulatory regions. This study successfully obtained the core promoter region and positive regulation regions of the Arctic foxgene, which laid a foundation for further study on the molecular genetic mechanism of this gene regulating Arctic fox coat color.

Arctic fox,gene, promoter activity, transcriptional regulatory element

February 13, 2019;

June 19, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Hebei Province (Nos. C2016407114, C2017407040, C2017407037), Program for the Top Young-aged Innovative Talents of Higher Learning Institutions of Hebei Province (No. BJ2016026).

Xianglong Li. Tel: +86-335-8069521; E-mail: lixianglongcn@yahoo.com

Yuanfang Gong. E-mail: gyfkeyan@163.com

河北省自然科學基金 (Nos. C2016407114, C2017407040, C2017407037)，河北省高等學校青年拔尖人才計劃項目 (No. BJ2016026) 資助。

郭敏, 趙子雅, 王瑞寧, 等. 北極狐β-防御素103基因 (CBD103) 啟動子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析. 生物工程學報, 2019, 35(8): 1469–1477.Guo M, Zhao ZY, Wang RN, et al. Activity and transcriptional regulatory elements of the promoter in Arctic fox (Vulpes lagopus) β-defensin103 gene. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1469–1477.

(本文責編 陳宏宇)