盛曉丹，黃迪海，郭卉，劉霞，秦卓明,2

融合蛋白TAT-RIG-I-GFP的原核表達(dá)及其跨膜遞送

盛曉丹1，黃迪海1，郭卉1，劉霞1，秦卓明1,2

1 山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250100 2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100

本研究旨在探討融合蛋白TAT-RIG-I-GFP原核表達(dá)載體的構(gòu)建并驗(yàn)證TAT在跨膜遞送中的作用。首先設(shè)計(jì)了4對(duì)特異性引物，克隆了綠頭鴨基因，構(gòu)建了pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP原核表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DE3細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用His60鎳親和層析柱純化，進(jìn)行SDS-PAGE；然后，將純化后的上述兩種表達(dá)蛋白分別孵育DF-1細(xì)胞；最后利用熒光顯微鏡觀察是否在DF-1細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的熒光。結(jié)果證實(shí)，攜帶有TAT的pET-TAT-RIG-I-GFP融合蛋白在DF-1細(xì)胞中顯示出明顯的綠色熒光；而不具有TAT的pET-RIG-I-GFP蛋白卻不能顯示綠色熒光。這表明攜帶TAT的融合蛋白已成功進(jìn)入DF-1細(xì)胞，并在跨膜遞送過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。上述為進(jìn)一步研制家禽的抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。

反式激活蛋白 (TAT)，RIG-I，融合蛋白，跨膜遞送

視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I (Retinoic acid induced gene I，) 作為RLRs家族的一員，是細(xì)胞內(nèi)重要的病原識(shí)別受體，由兩個(gè)串聯(lián)的N-端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)、DExD/H解旋酶結(jié)構(gòu)域和C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(CTD) 構(gòu)成[1]。RIG-I在天然免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，通過(guò)識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的病毒ssRNA和dsRNA，激活下游Ⅰ型IFN的抗病毒反應(yīng)。

近年來(lái)，諸多學(xué)者在鴨、鵝等水禽體內(nèi)克隆到基因和蛋白，并發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)IFN-Ⅰ型天然免疫反應(yīng)，如激活I(lǐng)RF-3、IFN-α/γ、Mxl、PKR等的表達(dá)，在抵抗禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、鴨坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMV) 等病原感染和清除病毒方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。由于雞體內(nèi)缺失受體，而鴨源、鵝源基因均可在DF-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并可識(shí)別H5N1等病毒核酸[4]，因此，基因在雞源細(xì)胞中的信號(hào)通路研究成為家禽抗病育種和抗病毒藥物篩選的焦點(diǎn)。

反式激活蛋白(Transactivator，TAT) 是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD) 超家族的成員，其與人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1) RNA 5?端LTR結(jié)合后能夠提高HIV基因的轉(zhuǎn)錄水平。TAT核心結(jié)構(gòu)域(YGRKKRRQRRR) 能夠攜帶蛋白質(zhì)、多肽、DNA等外源性大分子穿透生物膜和生物屏障進(jìn)入不同的細(xì)胞[5]。研究表明，TAT核心結(jié)構(gòu)域不僅能夠促進(jìn)大腸桿菌中的異源蛋白質(zhì)表達(dá)，還能提高異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和溶解度[6]。本研究構(gòu)建、GFP與TAT重組蛋白，探討其在DF-1細(xì)胞的跨膜遞送功能，為家禽抗病毒藥物的研制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DF-1細(xì)胞、DH5α由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所惠贈(zèng)，pCD513B由本實(shí)驗(yàn)室保存，健康綠頭鴨購(gòu)自濟(jì)南黃臺(tái)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試劑

Tks Gflex DNA Polymerase、In-Fusion?HD Cloning Kit、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ、pET28a (+) 載體、DL5000 DNA marker、His60 Ni Gravity Columns (鎳親和層析柱)、DMEM培養(yǎng)基、膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根公司；PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)綠頭鴨基因(GenBank登錄號(hào)：EU363349) 設(shè)計(jì)含有TAT核心結(jié)構(gòu)域序列的特異性引物P1、P2(下劃線部分為T(mén)AT序列)；按照In-Fusion?HD Cloning Kit說(shuō)明書(shū)要求，分別設(shè)計(jì)TAT-RIG-I和GFP的原核表達(dá)引物P3、P4和P5、P6。同時(shí)，根據(jù)序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)兩端帶接頭的RIG-I-GFP原核表達(dá)引物P7和P8 (表1)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-TAT-RIG-I的構(gòu)建

提取健康綠頭鴨的脾臟組織，按Chen等[2]方法制備其cDNA，并以其為模板，使用特異性引物P1、P2擴(kuò)增TAT-RIG-I片段。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，63 ℃ 15 s，68 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化回收，同時(shí)將其轉(zhuǎn)化至pET28a，挑選陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pET-TAT-RIG-I。

表1 本研究所用PCR引物

Note: the underlined part of the primer sequence is the Transactivator (TAT).

1.5 融合蛋白表達(dá)載體pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP的構(gòu)建

1.5.1 pET-TAT-RIG-I-GFP的構(gòu)建

以pET-TAT-RIG-I重組質(zhì)粒為模板，利用P3、P4為引物擴(kuò)增TAT-RIG-I片段；以pCD513B為模板，利用P5、P6為引物擴(kuò)增GFP。將擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，按照In-Fusion?HD Cloning Kit說(shuō)明書(shū)要求與含有Ⅰ、Ⅰ雙酶切的pET-28a(+)載體連接，構(gòu)建pET- TAT-RIG-I-GFP。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序。

1.5.2 pET-RIG-I-GFP的構(gòu)建

以pET-TAT-RIG-I-GFP為模板，P7、P8為引物擴(kuò)增RIG-I-GFP，構(gòu)建pET-RIG-I-GFP，方法同上。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、PCR鑒定和測(cè)序同1.5.1。

1.6 重組載體的蛋白表達(dá)、純化和SDS-PAGE

將pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DE3 (大腸桿菌BL21)，接種于含卡那霉素的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，劃取單菌落至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振搖過(guò)夜；次日按1︰100的體積比接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振搖1 h后添加IPTG使其濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)16 h后，離心收集菌體，PBS漂洗2次，超聲波裂解菌體(超聲破碎3 s，間隔4 s，超聲30次，功率為200 W)，4 ℃、10 000 r/min離心25 min，收集上清，采用His60 鎳親和層析柱分別對(duì)TAT-RIG-I-GFP和RIG-I-GFP的融合蛋白進(jìn)行純化和SDS-PAGE分析。同時(shí)，設(shè)未誘導(dǎo)的和未純化的菌體上清(同上處理) 作為對(duì)照。

1.7 融合蛋白的跨膜遞送

將純化后的TAT-RIG-I-GFP和RIG-I-GFP蛋白脫鹽處理，加入適量無(wú)血清DMEM稀釋。培養(yǎng)DF-1細(xì)胞至鋪滿單層，棄上清，清洗后分別加入1 mL TAT-RIG-I-GFP、RIG-I-GFP和無(wú)血清DMEM孵育1 h，用PBS清洗3遍后置于熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-TAT-RIG-I的構(gòu)建

以綠頭鴨的cDNA為模板，擴(kuò)增含TAT序列的基因并轉(zhuǎn)化至pET28a，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-TAT-RIG-I。經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的TAT-RIG-I片段，全長(zhǎng)為2 832 bp，其中的基因片段與綠頭鴨基因(GenBank登錄號(hào)：EU363349) 同源性為100% (圖1)。

2.2 帶有熒光標(biāo)記的重組質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建

按照1.5.1和1.5.2方法分別構(gòu)建帶有熒光標(biāo)記的pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，提取其質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序，擴(kuò)增出的目的基因片段長(zhǎng)度分別為3 546 bp和3 513 bp，結(jié)果符合預(yù)期。這表明TAT-RIG-I-GFP和RIG-I-GFP均已成功克隆至pET28a (+) 載體(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒TAT-RIG-I基因的PCR鑒定

圖2 重組質(zhì)粒TAT-RIG-I-GFP和RIG-I-GFP的PCR鑒定

2.3 重組載體的蛋白表達(dá)、純化和SDS-PAGE

將pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP兩種重組載體同時(shí)轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)細(xì)胞，增菌培養(yǎng)，分別進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該兩種重組載體在IPTG誘導(dǎo)后，其蛋白表達(dá)量明顯增高，且與IPTG未誘導(dǎo)組相比，在116.0–200.0 kDa之間明顯多出一個(gè)蛋白條帶，且經(jīng)過(guò)His60鎳親和層析柱純化后更加明顯，相對(duì)分子量約在130 kDa，二者的大小差異不大(圖3)。

2.4 攜帶TAT融合蛋白的跨膜遞送

利用純化和脫鹽處理的TAT-RIG-I-GFP和RIG-I-GFP兩種融合蛋白孵育DF-1細(xì)胞1 h后清洗，置于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TAT-RIG-I- GFP孵育的DF-1細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顯著的綠色熒光信號(hào)(200×)，而RIG-I-GFP、DMEM和DF-1細(xì)胞的空白對(duì)照組，其細(xì)胞內(nèi)均無(wú)綠色熒光。這表明攜帶TAT的融合蛋白可跨膜遞送進(jìn)入DF-1細(xì)胞，而未攜帶TAT的融合蛋白則不能進(jìn)入細(xì)胞(圖4)。

圖3 pET-TAT-RIG-I-GFP和pET-RIG-I-GFP的SDS-PAGE分析和比較

圖4 DF-1細(xì)胞不同組別處理的熒光顯微觀察(200×)

3 討論

基因在水禽抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮識(shí)別病毒核酸、激活Ⅰ型IFN的重要作用，并可識(shí)別內(nèi)源性RNA，如miR-136、miR-145和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒等。此外，RIG-I基因還參與抗菌免疫反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育分化等過(guò)程[7-9]。

在禽類(lèi)基因的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)AIV、NDV等感染水禽后主要被基因的受體識(shí)別，而該基因在雞體內(nèi)缺失，盡管雞體內(nèi)的MDA5和LGP2可以識(shí)別某些侵入雞源細(xì)胞的病毒，但該基因在進(jìn)化過(guò)程中受到負(fù)向凈化選擇，因此基因的缺失可能成為雞對(duì)禽流感、新城疫等病毒抵抗力低的主要原因之一[10]。研究表明，鴨源基因可在DF-1細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，并顯著抑制AIV活性[11]。利用Piggy Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鵝源基因的雞傳代細(xì)胞系，為研究雞源細(xì)胞抗病毒機(jī)制提供了良好的模型[12]。盡管基因?qū)μ岣唠u源細(xì)胞抗病毒能力的研究已有較大進(jìn)展，但該蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致其在臨床上應(yīng)用受限。TAT作為研究最多的細(xì)胞穿膜肽，富含堿性氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)特性使其具有較高正電荷，能與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的分子結(jié)合,并激活攜帶TAT的肽或蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[13-14]。TAT不僅可與抗體或功能性蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抑制病毒增殖，還可以與抗原結(jié)合以增強(qiáng)其免疫性[15-17]。與其他轉(zhuǎn)運(yùn)載體相比，TAT跨越生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高，且不受所攜帶的物質(zhì)大小影響，可轉(zhuǎn)導(dǎo)分子量超過(guò)100 kDa的蛋白，且不會(huì)改變所攜帶蛋白的活性和功能，更不會(huì)改變?cè)械募?xì)胞基因組結(jié)構(gòu)。TAT以其無(wú)細(xì)胞毒性和優(yōu)異的生物安全特性，而成為新型黏膜免疫佐劑和治療性蛋白質(zhì)藥物的研究熱點(diǎn)[18-19]。

此外，GFP作為報(bào)告基因，因其熒光信號(hào)穩(wěn)定、生物安全性好、便于觀察和檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于分子標(biāo)記、藥物篩選和融合抗體等研究。

本研究首次構(gòu)建了pET-TAT-RIG-I-GFP重組表達(dá)載體，并在DE3中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物(TAT-RIG-I-GFP融合蛋白)的相對(duì)分子質(zhì)量約為130 kDa，與預(yù)期的結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)純化和脫鹽處理，其能夠進(jìn)入DF-1細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下觀察到其細(xì)胞內(nèi)具有明顯的綠色熒光，而未攜帶TAT的RIG-I-GFP融合蛋白則不能進(jìn)入DF-1細(xì)胞。這表明，TAT在跨膜遞送過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

下一步的工作重點(diǎn)是對(duì)構(gòu)建的攜帶有TAT的表達(dá)蛋白及其抗病毒的生物學(xué)活性進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，進(jìn)而為家禽的抗病毒藥物篩選和轉(zhuǎn)基因抗禽流感品種雞的培育奠定良好的基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and transmembrane transfer of fusion protein TAT-RIG-I-GFP

Xiaodan Sheng1, Dihai Huang1, Hui Guo1, Xia Liu1, and Zhuoming Qin1,2

1 Shandong Jianmu Biological Pharmaceutical Co., Ltd., Jinan 250100, Shandong, China 2 Institute of Poultry Science, Shandong Academy of Agricultural Science, Jinan 250100, Shandong, China

We studied the construction of fusion protein TAT-RIG-I-GFP prokaryotic expression vector and verified the function of TAT in transmembrane delivery. First, four pairs of specific primers were designed, and thegene of Mallard Duck () was cloned. Then, the pET-TAT-RIG-I-GFP and pET-RIG-I-GFP prokaryotic expression vectors were constructed. Meanwhile, they were converted to.BL21 (DE3), which were induced to be expressed after culture. After the purification of His-60 nickel affinity chromatography column and the identification of SDS-PAGE, the purified TAT-RIG-I-GFP and RIG-I-GFP proteins were incubated to DF-1 cells. Finally, fluorescence microscopy was used to observe whether the corresponding fluorescence was produced in DF-1 cells. The results showed that pET-TAT-RIG-I-GFP fusion with TAT showed obvious green fluorescence in DF-1 cells. However, the pET-RIG-I-GFP without TAT cannot display green fluorescence. This shows that TAT-fused protein have successfully delivered DF-1 cells and play a key role in transmembrane delivery. In conclusion, these results provide a solid material basis for further study of antiviral drugs in poultry.

TAT, RIG-I, fusion protein, transmembrane delivery

March 24, 2019;

June 3, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2014CP023).

Zhuoming Qin. Tel: +86-531-88972914; E-mail: qinzm1997@163.com.

山東省自然科學(xué)基金 (No. ZR2014CP023) 資助。

2019-06-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190620.1625.002.html

盛曉丹, 黃迪海, 郭卉, 等. 融合蛋白TAT-RIG-I-GFP的原核表達(dá)及其跨膜遞送. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1463–1468.Sheng XD, Huang DH, Guo H, et al. Prokaryotic expression and transmembrane transfer of fusion protein TAT-RIG-I-GFP. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1463–1468.

(本文責(zé)編 郝麗芳)