鄭 宇， 趙翠梅， 吳亞楠， 劉 靜， 程 程，石 磊， 萬守朋， 王 敏,*

(1.食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室/天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術工程中心/天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.天津市利民調料有限公司，天津 300308)

作為山西地理標志產品，山西老陳醋以其獨特的色、香、醇、濃和酸五大特征聞名于世[1]，其釀制工藝被列為國家級非物質文化遺產。山西老陳醋是以高粱、麩皮、谷糠和水為主要原料，以大麥、豌豆所制大曲為糖化發(fā)酵劑，經酒精發(fā)酵后，再經固態(tài)醋酸發(fā)酵、熏醅、陳釀等工序釀制而成[2]。由于釀造原料豐富，釀造工藝獨特，參與發(fā)酵的微生物種類眾多，賦予了山西老陳醋獨特的風味。

食醋的整體風味主要由氣味和滋味，即揮發(fā)性成分和不揮發(fā)性成分兩部分組成。揮發(fā)性成分包括揮發(fā)性酸類、酯類、醇類、醛類、雜環(huán)化合物等[3]，不揮發(fā)性成分主要由有機酸、氨基酸、糖類組成，其中，酸味和鮮味是食醋給人的主要感官感受，有機酸和氨基酸對其風味影響較大[4]。頂空固相微萃取- 氣相色譜- 質譜聯(lián)用(HS-SMPE-GC-MS)技術可用于提取和鑒定山西老陳醋中的揮發(fā)性成分[5-6]，結合氣相色譜- 嗅辨儀聯(lián)用(GC-O)技術可對其中主要化合物的風味特征進行分析[7]。在感官分析中，不同物質的感官閾值差異很大[8]，揮發(fā)性成分和不揮發(fā)性成分對食醋整體風味的貢獻是由其在食醋風味體系中的濃度和感覺閾值共同決定的[9-10]。相對氣味活度值(ROAV)法[11]可以將風味化合物的濃度和閾值聯(lián)系起來，按照揮發(fā)性物質的香氣屬性將其分類，并把同類香氣屬性的揮發(fā)性物質的ROAV值相加，以各類香氣屬性ROAV值總和繪制香氣輪。香氣活性值香氣輪的優(yōu)勢在于可以將化學信息轉化為感官描述信息，雖然香氣活性值香氣輪不能代替感官香氣輪，而感官香氣輪往往需要專業(yè)品評人員，且受主觀感受差別大。在感官分析條件不具備時，香氣活性值香氣輪可以初步描繪樣品的感官信息[12-14]。

山西老陳醋具有悠久的歷史，隨著技術的進步，自動翻醅機、機械熏醅罐等設備逐漸應用于山西老陳醋的生產[7,11]，但目前對山西老陳醋風味分析研究仍不夠深入，缺乏客觀的風味評價依據，企業(yè)在進行技術升級和設備改造的時候缺乏有效的評價手段來指導工藝的優(yōu)化。采用HS-SMPE-GC-MS、HPLC和氨基酸自動分析儀等設備分析不同品牌山西老陳醋揮發(fā)性成分、有機酸和氨基酸等主要風味物質組成，特別地，采用ROAV和味覺強度來描繪山西老陳醋風味特征，可以為建立科學、統(tǒng)一的山西老陳醋感官評價體系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 山西老陳醋樣品

分別從山西太原、晉中等地選購不同廠家山西老陳醋樣品，為便于分析比較，所購樣品陳釀時間均為3年，總酸為6.0～6.5 g/(100 mL)，6個品牌樣品編號分別為1～6。

1.2 儀器與試劑

6890N-5975B型氣相色譜- 質譜聯(lián)用儀，美國Agilent科技有限公司；固相微萃取裝置包括手柄、導向桿、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭，美國Supelco公司；1200型高效液相色譜分析儀(紫外檢測器)，美國Agilent科技有限公司；S-433D型氨基酸自動分析儀，德國SYKAM公司；電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；NaCl(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1揮發(fā)性風味成分分析

1.3.1.1 固相微萃取條件

將萃取纖維頭于250 ℃下老化20 min，直至無干擾峰出現(xiàn)。取2.0 mL食醋、6.0 mL去離子水加入樣品瓶中，并加入1.0 g NaCl、1.0 μL 1.6 mg/mL 2-辛醇(內標)和攪拌子，蓋好后置于60 ℃的恒溫水浴中。將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭使之與醋液面保持2 cm的距離，萃取時間為40 min，攪拌速度為200 r/min，然后抽出纖維頭，再將萃取頭插入氣相色譜進樣口，同時啟動儀器，采集數據，待纖維頭于230 ℃解吸5 min后抽出纖維頭。

1.3.1.2 GC-MS分析條件

GC條件：進樣口溫度220 ℃，柱流速為恒定流量1 mL/min，分流比為5，程序升溫起始溫度40 ℃，以4 ℃/min升到150 ℃，然后以8 ℃/min升到250 ℃保持6 min。MS條件：接口溫度220 ℃，離子源溫度230 ℃，數據采集模式全掃描，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z 35～500。所得質譜數據與NIST數據庫對照，對匹配度大于80(最大為100)的鑒定結果予以確認，利用圖譜庫工作站數據處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進行定量分析，求得各樣品中揮發(fā)性風味物質成分的相對含量。

1.3.2有機酸分析

1.3.2.1 HPLC分析條件

取2.0 mL樣品稀釋液于2 mL EP管內，12 000 r/min轉速離心5 min后取上清液，濾液經0.45 μm濾膜過濾后，采用HPLC法檢測每個樣品。色譜柱：Aminex HPX-87H lon Exclusion Column(7.8 mm×300 mm)，柱溫30 ℃，流速0.6 mL/min，紫外檢測器波長215 nm，流動相為5 mmol/L硫酸，運行時間為30 min。

1.3.2.2 主要有機酸濃度測定

將乙酸、乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等標準品儲存液稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進樣并確定保留時間。繪制標準曲線，用于樣品中有機酸的定量分析。

1.3.3游離氨基酸分析

1.3.3.1 氨基酸自動分析儀檢測條件

將醋樣稀釋20倍，取200.0 μL稀釋后的樣品加入800.0 μL 2%的水楊酸，靜置30 min后，13 000 r/min離心15 min，取離心后的上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。采用氨基酸自動分析儀，檢測柱為Na+型陽離子分離柱(LCA K06)，柱溫為30～70 ℃，紫外檢測器波長440～570 nm，緩沖液為鈉鹽緩沖液，流速為0.45 mL/min。梯度洗脫衍生試劑為茚三酮溶液，流速0.25 mL/min，進樣量50 μL，分析時間60 min，反應溫度130 ℃。

1.3.3.2 氨基酸的定性與定量分析

將SYKAM公司原裝H型氨基酸標準溶液稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進樣并確定保留時間。繪制氨基酸系列標準曲線回歸方程，用于樣品中氨基酸的定量分析。

1.3.4主要風味成分評價方法

1.3.4.1 揮發(fā)性風味成分[11]

對于特征風味成分的確定采用ROAV法，評價各揮發(fā)性成分對樣品整體香氣的貢獻，即：

(1)

式(1)中：Ci、Ti，各揮發(fā)性物質的相對含量(%)和對應的感覺閾值(mg·L-1)；Cmax、Tmax，對樣品總體風味貢獻最大的組分的相對含量(%)和對應的感覺閾值(mg·L-1)。

1.3.4.2 不揮發(fā)性風味成分

計算有機酸、游離氨基酸對滋味的貢獻度，即味覺強度值(TAV)，表示為各個呈味物質的含量與其閾值的比。當TAV大于1時，認為該物質對呈味有貢獻，而當TAV小于1時，認為該物質對呈味沒有貢獻。

1.3.5風味輪的繪制

1.3.5.1 香氣輪的繪制

由揮發(fā)性物質根據文獻檢索的信息，將同一香氣屬性的揮發(fā)性物質的ROAV相加，即為山西老陳醋該香氣屬性的得分，將各個香氣屬性的得分繪制成雷達圖，即為山西老陳醋的香氣輪。

1.3.5.2 滋味輪的繪制

將不揮發(fā)性物質的味覺屬性分為酸、甜、苦、鮮四大類，計算各個化合物的味覺強度，并歸納相加，由其各個屬性得分繪制雷達圖，即為山西老陳醋的滋味輪。

2 結果與討論

2.1 山西老陳醋中主要風味物質分析

2.1.1揮發(fā)性成分定性定量分析

應用固相微萃取- 氣相色譜- 質譜聯(lián)用儀對山西老陳醋中揮發(fā)性風味成分進行測定，共測定出95種風味成分，實驗結果見表1。根據鑒定結果，檢測出揮發(fā)性風味成分主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、酮類和雜環(huán)化合物等。乙酸是食醋中最主要的揮發(fā)性風味物質，對食醋的風味有重要影響，但受到固相萃取效率、解吸附效率等方面的影響，HS-SPME-GC-MS方法并不適合檢測乙酸濃度。因此本研究采用HPLC法對乙酸等有機酸濃度進行分析，并在HS-SPME-GC-MS數據中刪除乙酸相對濃度。由表1可見，除乙酸外，山西老陳醋中揮發(fā)性風味成分相對含量較高的是糠醛、乙酸乙酯、2，3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮和四甲基吡嗪，相對含量分別為38.12%、3.07%、3.05%、3.38%和6.48%。

2.1.2揮發(fā)性香氣化合物ROAV 特性分析

山西老陳醋中主要的揮發(fā)性風味物質分為7類，包括酸類、酯類、醇類、醛類、酮類、吡嗪類和酚類。對鑒定的6個樣品中共有的20種風味化合物在山西老陳醋中的特征進行了分析，結果如表2。表2中，ROAV≥1.00的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.10≤ROAV<1.00的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用[11]，其主體香氣成分有以下5種：乙酸、苯甲醛、糠醛、2,3-丁二酮和四甲基吡嗪。

酸類、醛類和吡嗪類是山西老陳醋中的主要呈香物質，其次是酮類和酯類化合物，不同的揮發(fā)性成分具有不同的香氣貢獻。酸類物質作為山西老陳醋香氣的主要構成物質既是呈味物質又具香氣特征，決定了食醋的風味和品質，其中乙酸具有愉快的酸香氣味，3-甲基丁酸、己酸具有明顯的干酪味、酸臭味以及窖泥香風味，在食醋中其他組分的協(xié)調作用下，構成食醋獨特的風味[18-19]。醛類物質是通過微生物的發(fā)酵作用或者氨基酸的降解作用產生的，其中苯甲醛，又稱安息香醛，是工業(yè)上最常使用的芳香醛，具有特殊的杏仁氣味；糠醛，亦稱2-呋喃甲醛，具有甜香、木香、面包香和焦糖香，并帶有烘烤食品的氣味[20]。吡嗪類物質是山西老陳醋熏醅過程中產生的特有香氣物質之一，主要是通過Strecker降解反應將氮源(如氨基酸)降解而成的，其中四甲基吡嗪又稱川芎嗪，具有咖啡味、烘烤花生味等特殊香氣，此外還具有降血壓等功效。由方差分析可知，在不同廠家的山西老陳醋中，不同物質ROAV差別較大，其中3-甲基丁酸、苯甲醛在各樣品中差異顯著，且乙酸苯乙酯、糠醇、5-甲基糠醛、三甲基吡嗪等物質ROAV的差異極其顯著，因山西老陳醋采用的主要原料和生產工藝類似，這些香氣成分有可能是不同廠家在原料配比和發(fā)酵過程控制方面的差異導致的；同時，也說明這些存在差異的風味特征容易受到生產過程操作的影響，這些風味特征也應該是各生產企業(yè)在發(fā)酵過程控制和新設備、新工藝的應用時需要特別注意的。

表1 山西老陳醋風味成分相對含量

續(xù)表1

續(xù)表1

“-”，未檢測到該化合物或在檢測限以下。

表2 山西老陳醋香氣成分閾值分析

“-”，P>0.1，差異不顯著；“*”，P<0.1，差異顯著；“**”，P<0.05，差異極顯著。

2.2 山西老陳醋有機酸風味分析

利用HPLC法對6個品牌的山西老陳醋樣品中的主要有機酸進行了分析，共檢測了7種有機酸，其中含量較高的有機酸依次是乙酸(54.00～56.10 mg/mL)、乳酸(29.37～32.63 mg/mL)，其次為檸檬酸(1.69～1.95 mg/mL)、琥珀酸(1.31～1.57 mg/mL)和酒石酸(0.76～0.92 mg/mL)等。乙酸和乳酸是山西老陳醋的主體有機酸，且二者分別屬于揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸，除乳酸外，酒石酸、檸檬酸和琥珀酸等同屬不揮發(fā)酸，能夠調和食醋的酸味，減少乙酸對味覺的刺激，使得食醋口感更加柔和。

根據每種有機酸含量及對應的味覺閾值，判斷有機酸的味覺強度，以此來分析每種有機酸對山西老陳醋的整體酸味貢獻情況。味覺強度TAV越大，說明貢獻越大，當TAV<1時，味感可忽略不計。山西老陳醋中每種有機酸的味覺強度情況見表3。表3中，乙酸、乳酸的味覺強度占其總酸味強度比分別為61.31%～65.08%、32.46%～35.94%，檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和草酸占比分別為0.88%～1.00%、0.74%～0.84%、0.33%～0.43%、1.13%～1.46%、0.039%～0.053%。乙酸、乳酸不僅是山西老陳醋中濃度最高的主體酸，也是對產品風味貢獻最大的兩種有機酸，其他有機酸作為輔助整體酸味味感的特征成分，協(xié)同主體有機酸形成山西老陳醋獨特的酸味口感。檸檬酸具有清爽，帶新鮮感刺激的酸味；琥珀酸是酵母菌發(fā)酵的代謝產物，具有鮮酸爽口的滋味[22]；蘋果酸是特有的有機酸，帶有刺激的、爽快的酸味。由顯著性分析可知，不同樣品有機酸的滋味貢獻差別較大，除乳酸外，其余6種有機酸TAV差異極顯著(P<0.05)，可能與不同企業(yè)的發(fā)酵過程控制相關。食醋中的大部分有機酸是在制曲和發(fā)酵過程中由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物產生的，而微生物的代謝受環(huán)境影響巨大。6種樣品雖同為山西老陳醋，但在生產過程中人為或機械操作、條件控制等不盡相同，進而形成了有機酸含量的差異。

表3 山西老陳醋中有機酸風味強度分析

“*”，P<0.1，差異顯著；“**”，P<0.05，差異極顯著。

2.3 山西老陳醋中氨基酸風味分析

采用氨基酸自動分析儀對食醋樣品中的氨基酸成分進行測定，共檢測了15種氨基酸(表4)。各樣品中氨基酸種類組成情況差異不大，其中天冬氨酸(7.1%～10.2%)、谷氨酸(6.9%～8.8%)、丙氨酸(14.6%～19.7%)、胱氨酸(1.4%～18.5%)、纈氨酸(7.5%～8.7%)、亮氨酸(7.5%～11.3%)和脯氨酸(4.8%～8.1%)含量較高。相關文獻對中國傳統(tǒng)食醋主要釀造原料高粱、糯米、小麥麩皮的氨基酸組成分析中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、纈氨酸在3種谷物中的含量最高[23]，這與本研究所測食醋樣品中丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、谷氨酸含量最高的結果一致。

根據氨基酸風味特征[24]，將對滋味有貢獻的氨基酸分為3類，分別為鮮味、甜味和苦味，將各類氨基酸對照其在水中的呈味閾值，計算出各自的TAV，結果見表4。苦味、甜味和鮮味氨基酸TAV分別為：48.08%～51.65%、28.67%～29.58%和20.25%～21.92%。苦味氨基酸在6個品牌食醋樣品中均有滋味貢獻，但是食醋中鮮有苦味感，這可能與滋味間的相互作用有關。纈氨酸、組氨酸的TAV為1.72～1.82和2.35～2.49，對醋的苦味有顯著的影響；谷氨酸、丙氨酸TAV為2.15～2.31和2.78～2.85，對醋的鮮味和甜味有顯著影響。不同的氨基酸呈現(xiàn)出不同的滋味，各種滋味相互協(xié)調賦予了食醋獨特的口味。方差分析表明，同種氨基酸在不同樣品間差異較大，尤其是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、組氨酸等差異極顯著。山西老陳醋釀造過程中氨基酸濃度先升高后降低，其濃度變化主要是由于原料中蛋白質降解產生了氨基酸，同時發(fā)酵過程微生物的代謝等作用導致氨基酸濃度變化[25]；此外，山西老陳醋熏醅過程中氨基酸會與糖類發(fā)生美拉德反應，因此不同廠家采用的熏醅溫度以及時間等影響食醋中氨基酸的含量。

表4 山西老陳醋中氨基酸風味強度分析

“-”，P>0.1，差異不顯著；“*”，P<0.1，差異顯著；“**”，P<0.05，差異極顯著。

2.4 山西老陳醋風味輪的繪制

食醋的整體風味主要由氣味和滋味組成，即風味物質包括揮發(fā)性物質和非揮發(fā)性物質。為了將揮發(fā)性物質的含量數據轉化為感官描述信息，本研究將具有同類香氣屬性的揮發(fā)性物質分為一組，共分為6個香氣屬性，分別為甜香、烘烤香、堅果香、酸香、花果香和奶香。將每個香氣屬性中的揮發(fā)性物質的ROAV相加，通過雷達圖進行表征，即為山西老陳醋的香氣輪，見圖1(右側)。香氣輪可以較好地將化合物組成與香氣特征相聯(lián)系,可以得到初步的感官描述信息。從圖1中可直觀看出，6個山西老陳醋樣品的香氣輪形狀相似，山西老陳醋中最主要的2個香氣特征是酸性氣味和烘烤香，其次為堅果香、甜香和奶香，花果香最低。同時，通過香氣輪可以比較不同品牌山西老陳醋的感官特征，如與其他食醋相比，山西老陳醋最獨特的香味是烘烤香，這與其獨特的熏醅工藝相關。

食醋滋味是判斷食醋優(yōu)劣的重要依據，食醋的滋味主要有酸味、苦味、甜味、咸味和鮮味。由于評價食醋的滋味涉及的因素較多，各滋味感官特性的強度高低不同，且各滋味之間相互影響，本研究不考慮化合物間的相互作用及味感相互融合等因素，從主要呈味化合物及味覺感應角度出發(fā)，描述山西老陳醋的滋味感官信息，結合有機酸和氨基酸的含量及對應的味覺閾值，計算各個化合物的味覺強度，并進行整合，繪制山西老陳醋滋味輪，見圖1(左側)。食醋有機酸的味覺強度遠高于氨基酸，是醋的主要風味物質。從滋味輪中可明顯觀察到山西老陳醋中酸味為主體味覺，苦味和甜味次之，并有少許的鮮味。

圖1 山西老陳醋風味輪分析Fig.1 Flavor wheel of Shanxi aged vinegar

3 結 論

分別對山西老陳醋中揮發(fā)性成分、有機酸、氨基酸等主要風味物質的組成進行了分析，進一步采用風味強度的方法對其風味特征進行了評價。乙酸、苯甲醛、糠醛和2，3-丁二酮和四甲基吡嗪是山西老陳醋中重要的特征風味化合物。從風味輪中可直觀觀察到山西老陳醋的香氣和味覺組成及特征，其中酸味和烘烤香尤其突出。烘烤香是山西老陳醋特有的香氣特征，酸味占據主體味覺感受，伴有少許甜味及苦味，且微帶有鮮味。山西老陳醋各廠家采用的原輔料、生產工藝大同小異，故該風味輪中6個品牌食醋的差異并不明顯，具有較好的代表性。本研究采用風味化學的方法系統(tǒng)評價了食醋的感官風味組成，希望為山西老陳醋生產企業(yè)進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，改善產品風味品質提供依據。