李愛華， 汪興杰， 劉 浩， 陶永勝,3，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心， 陜西 楊凌 712100)

香氣是葡萄酒的重要感官特征，葡萄酒中香氣物質(zhì)主要分為品種香氣成分、發(fā)酵香氣成分和陳釀香氣成分。品種香氣成分的前體主要是糖苷結(jié)合態(tài)的香氣化合物，香氣糖苷是結(jié)合態(tài)的香氣物質(zhì)，發(fā)酵過程中酵母分泌的糖苷酶能夠促進(jìn)葡萄香氣糖苷的水解，釋放出游離的品種香氣成分，表現(xiàn)出典型的品種香氣特征[1]。發(fā)酵香氣成分主要來源于酵母主導(dǎo)的葡萄糖代謝路徑[2]。其中，酯類物質(zhì)雖然在含量上低于高級(jí)醇含量，但由于其嗅覺閾值較低，因此是發(fā)酵香氣成分中主要的呈香物質(zhì)，且通常是果香的貢獻(xiàn)者[3]。辛酸乙酯是葡萄酒發(fā)酵中果香酯類的代表性物質(zhì)，在模擬葡萄酒中的嗅覺閾值僅為2～5 μg/L[4-6]，而檢出量通常高于閾值，因此是葡萄酒果香和花香的有力貢獻(xiàn)者，并且葡萄酒發(fā)酵過程中辛酸的合成及其順利乙酸酯化是酵母風(fēng)味物質(zhì)代謝的典型案例。乙酸苯乙酯作為苯乙基類化合物的重要呈香物質(zhì)，呈現(xiàn)令人愉悅的甜香[7-8]，在葡萄酒中的檢出量通常為幾十μg/L，而嗅覺閾值為250 μg/L[7,9]，香氣活性值在0.1～1之間。研究認(rèn)為糖苷前體水解和酵母代謝是乙酸苯乙酯生成的限速底物苯乙醇在發(fā)酵過程中的主要來源[10]。因此研究辛酸乙酯和乙酸苯乙酯在發(fā)酵過程中的生成過程，有助于了解酵母發(fā)酵特性，從而優(yōu)化發(fā)酵工藝。

由于單一釀酒酵母菌株的發(fā)酵，易造成葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量的單一化和趨同化[11-12]，最近十年，一些具有較高風(fēng)味酶活性的非釀酒酵母菌株引起了研究者的注意，優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵成為增加葡萄酒風(fēng)味復(fù)雜性的研究熱點(diǎn)[13-14]。深入研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵表現(xiàn)出增香效果的同時(shí)，非釀酒酵母過多地參與發(fā)酵有可能給葡萄酒帶來異味，如動(dòng)物、真菌等氣味[15]。為了避免非釀酒酵母在混合發(fā)酵中的負(fù)面作用，本研究在釀酒酵母發(fā)酵過程中添加優(yōu)選野生酵母的胞外酶提取物，研究其對(duì)辛酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的影響。實(shí)驗(yàn)以模擬葡萄汁為發(fā)酵基質(zhì)，添加n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，采用優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶促進(jìn)釀酒酵母發(fā)酵過程中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯的生成，實(shí)驗(yàn)同時(shí)以商業(yè)糖苷酶和果膠酶處理為參照，探究優(yōu)選酵母胞外酶處理對(duì)兩種果香酯類物質(zhì)生成的影響，為優(yōu)選酵母及其胞外酶進(jìn)行葡萄酒增香釀造提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 酵母與酶制劑

釀酒酵母活性干粉ACTIFLORE F33購自法國Laffort公司；商業(yè)果膠酶(LAFASE HE GRAND CRU)購自法國Laffort公司，β-D-葡萄糖苷酶的活性300 U/g；商業(yè)糖苷酶制劑AR2000購于荷蘭DSM集團(tuán)，β-D-葡萄糖苷酶的活性1 000 U/g。

1.2 儀器與試劑

GC- MS- QP2020氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；UV- 2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；TGL- 16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DGX- 9243BC型鼓風(fēng)干燥箱、NRY- 2102C型立式恒溫?fù)u床、MP- 250B型恒溫培養(yǎng)箱，均為上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；果糖，北京索萊寶科技有限公司；一水合檸檬酸、硫酸鎂、氯化銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、氯化鈉和無水乙醇，四川西隴化學(xué)試劑有限公司；酒石酸、單寧酸和亞硫酸(SO2含量不低于6%)，天津天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司。

n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(純度≥98%)，苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(純度≥98%)，L-蘋果酸，均購自上海源葉生物科技有限公司；辛酸(純度≥98%)、辛酸乙酯(純度≥98%)、苯乙醇(純度≥99%)、乙酸苯乙酯(純度≥98%)和2-辛醇(純度≥99%)，均購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1非釀酒酵母胞外酶提取物制備及其酶活測定

發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)是以葡萄酒、果酒增香釀造為目標(biāo)由實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選獲得[13,16]。酵母胞外酶液參照Sun等[17]方法制備，粗酶液經(jīng) PEG 20000濃縮20倍，分析糖苷酶、酯酶和蛋白酶的活性。

糖苷酶活性分析：反應(yīng)體系為0.75 mL pH=5.0的檸檬酸- 磷酸鹽緩沖液，分別添加0.25 mL 1 mmol·L-1待測糖苷酶的對(duì)應(yīng)底物，對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基-β-D-半乳糖苷、對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷和對(duì)硝基苯基-α-L-鼠李糖苷，同時(shí)分別添加0.1 mL酵母胞外粗酶液。40 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 0.5 mol·L-1的碳酸鈉終止反應(yīng)，隨后測定反應(yīng)液在400 nm的吸光值。其中，以蒸餾水代替反應(yīng)底物作為對(duì)照組，每個(gè)樣品重復(fù)3次。一個(gè)單位β-D-葡萄糖苷酶酶活單位定義為：在40 ℃的條件下，每分鐘催化生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所要的酶量。

酯酶活性分析：參照Pérez-Martín等[18]的測定方法，以C4碳鏈長度的酯水解能力表示。

蛋白酶活性分析：參照Guleria等[19]的測定方法，一個(gè)單位蛋白酶活性定義為在60 ℃條件下，每分鐘催化生成1 μmol酪氨酸所需的酶量。

1.3.2模擬發(fā)酵體系中的酶促水解實(shí)驗(yàn)

模擬葡萄汁的配制參考Chassagne等[20]，略作修改。模擬葡萄汁以水為溶劑，1 L組分包括110 g葡萄糖，110 g果糖，3 g酒石酸，0.3 g蘋果酸，0.5 g氯化銨，0.6 g酵母浸粉，2.0 g單寧酸，2.0 g磷酸二氫鉀，0.2 g 硫酸鎂。充分混勻后，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至3.4，滅菌后備用。

香氣糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制方法參考Hampel等[21]，n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的配置濃度分別為1.33 mg/mL和6.09 mg/mL。模擬葡萄汁分別添加兩種香氣糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL/L，再添加SO260 mg/L，30 min后不同處理按β-D-葡萄糖苷酶活5 U/L分別添加商業(yè)糖苷酶制劑AR2000、果膠酶(PEC)、葡萄汁有孢漢遜酵母胞外酶提取液(HU)、發(fā)酵畢赤酵母胞外酶提取液(PF)于模擬葡萄汁中，同時(shí)以未添加香氣糖苷和酶制劑的模擬葡萄汁為對(duì)照(CK)。12 h后接種活化釀酒酵母200 mg/L啟動(dòng)發(fā)酵。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在20 ℃恒溫條件進(jìn)行。發(fā)酵過程中，每隔48 h測定酒精度和還原糖消耗量，測定方法參考文獻(xiàn)[22]。同時(shí)留存發(fā)酵葡萄汁50 mL于-20 ℃冷凍，用于香氣成分分析。當(dāng)發(fā)酵液比重降為0.992～0.994，且殘?zhí)?2 g/L，終止發(fā)酵。

1.3.3香氣成分分析

模擬發(fā)酵樣品中香氣物質(zhì)采用固相微萃取(solid phase micro-extraction)提取，進(jìn)行GC-MS分析，具體方法參照Wang等[23]。

SPME方法：在15 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中加入8 mL酒樣(含內(nèi)標(biāo)物)或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入2.0 g NaCl，然后將頂空瓶放入電磁攪拌器上水浴，40 ℃條件下平衡15 min；插入萃取纖維CAR/DVB/PDMS(50 μm/30 μm萃取頭，Supelco公司，USA)，40 ℃吸附30 min，立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解吸8 min，用于GC-MS分析。

GC-MS分析條件：無分流進(jìn)樣；色譜柱為DB-WAXETR氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W公司，USA)；柱升溫程序?yàn)橐?.0 ℃/min從40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升至250 ℃，保持8 min。離子源溫度250 ℃，連接桿溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，電壓70 eV，質(zhì)譜掃描范圍25～350 u，掃描速率0.2次/s。

定性定量方法：采用與香氣標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比的方法定性，以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)- 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行目標(biāo)香氣物質(zhì)數(shù)據(jù)的單因素方差分析和多重比較，采用Origin Pro 9.3繪制目標(biāo)香氣物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母胞外提取物中酶活分析

表1是兩株酵母胞外提取物中酶活分析結(jié)果，兩株酵母分泌的胞外酶中與葡萄酒風(fēng)味形成直接相關(guān)的酶有糖苷酶、酯酶和蛋白酶。

表1 酵母胞外提取物中的酶活分析

同一行數(shù)據(jù)不同字母表示差異性顯著水平(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)檢測了5種糖苷酶的酶活，結(jié)果顯示兩株酵母胞外酶中糖苷酶的活性較高，并且差異顯著，其中PF中β-D-葡萄糖苷酶活性較高，而HU中α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和β-D-半乳糖苷酶的活性較高。而對(duì)于酯酶和蛋白酶，PF中的活性明顯高于HU的。酵母胞外酶中的酶活及其差異最終將影響代謝產(chǎn)物的生成，實(shí)驗(yàn)將分析胞外酶處理對(duì)辛酸乙酯和乙酸苯乙酯生成的影響。

2.2 發(fā)酵過程中還原糖消耗和酒精生成的變化

模擬發(fā)酵體系中還原糖消耗和酒精生成的動(dòng)態(tài)變化分別如圖1(a)和圖1(b)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各處理的還原糖消耗總量基本一致，但酒精最終生成量略有不同，酵母胞外酶處理的酒精度略有降低。酵母胞外酶處理組HU和PF在發(fā)酵中期，即第4～12天，還原糖消耗更快，且酒度生成速度也更快，說明酵母胞外酶處理明顯影響了酒精發(fā)酵進(jìn)程。

圖1 模擬發(fā)酵過程中還原糖的消耗過程和酒度的生成過程Fig.1 Residual sugar consumption and alcohol degree formation during simulated fermentation

圖2 模擬發(fā)酵過程中目標(biāo)香氣物質(zhì)的生成過程Fig.2 Progress of objective aroma compounds during simulated fermentation

2.3 目標(biāo)香氣物質(zhì)的生成過程分析

圖2是目標(biāo)香氣物質(zhì)在對(duì)照和酶處理發(fā)酵過程中的生成過程。

總體上，辛酸、辛酸乙酯、苯乙醇和乙酸苯乙酯的含量均呈現(xiàn)先增后減并趨于穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。辛酸乙酯在發(fā)酵后期的含量下降幅度雖然比乙酸苯乙酯大，但辛酸乙酯的最終生成量明顯高于乙酸苯乙酯。

不同酶制劑處理對(duì)目標(biāo)香氣成分的生成過程及其最終生成量均有促進(jìn)作用，其中HU和PF胞外酶在發(fā)酵過程中對(duì)目標(biāo)香氣成分生成的促進(jìn)作用表現(xiàn)明顯。HU和PF在發(fā)酵后期對(duì)辛酸乙酯的促進(jìn)生成量雖低于AR2000，但顯著高于PEC，而HU和PF促進(jìn)乙酸苯乙酯的作用最為顯著，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的酶促增量分別達(dá)到了CK生成量的1.76和2.00倍。由圖2可見，辛酸與辛酸乙酯的最大生成區(qū)間是發(fā)酵的第4～8天，而后趨于下降，而苯乙醇和乙酸苯乙酯的最大生成區(qū)間是發(fā)酵的第6～14天，之后趨于平穩(wěn)。相比于發(fā)酵過程中的最大生成量，本研究對(duì)目標(biāo)香氣成分在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的損失率進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果見表2?？傮w上，不同處理間的損失率差異顯著，其中以CK的損失率最大，而尤以辛酸和辛酸乙酯的損失率最大。比較而言，HU和PF處理有助于辛酸乙酯和乙酸苯乙酯的生成，AR2000處理在辛酸乙酯生成上優(yōu)于HU和PF處理，但在乙酸苯乙酯的生成上HU和PF處理優(yōu)于AR2000處理。

表2 發(fā)酵結(jié)束時(shí)目標(biāo)香氣物質(zhì)的損失率

同一列數(shù)據(jù)不同字母表示差異性顯著水平(P<0.05)；“—”表示沒有損失。

2.4 目標(biāo)香氣物質(zhì)的生成來源分析

假設(shè)目標(biāo)香氣物質(zhì)的生成來源有3部分，純酵母發(fā)酵代謝、糖苷前體水解和酶制劑促進(jìn)生成，因此用目標(biāo)香氣物質(zhì)的量來比較生成量之間的差別。發(fā)酵結(jié)束時(shí)各處理組中辛酸、辛酸乙酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯的物質(zhì)量分析結(jié)果見表3?？梢源_定，(辛酸+辛酸乙酯)和(苯乙醇+乙酸苯乙酯)的純發(fā)酵生成量遠(yuǎn)高于對(duì)應(yīng)香氣糖苷——n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷的完全水解的最大生成量。n-辛基-β-D-葡萄糖苷水解和苯基-β-D-葡萄糖苷完全水解后生成對(duì)應(yīng)香氣物質(zhì)的含量分別為4.6 μmol/L和23.8 μmol/L，而在對(duì)照的純酵母發(fā)酵代謝中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)(辛酸+辛酸乙酯)的生成量為6.9 μmol/L，而(苯乙醇+乙酸苯乙酯)的生成量達(dá)到了591.1 μmol/L。

表3 模擬發(fā)酵過程中目標(biāo)香氣物質(zhì)的最大生成量

同一行數(shù)據(jù)不同字母表示差異性顯著水平(P<0.05)；“—”表示無差值。

在目標(biāo)香氣物質(zhì)最大生成量時(shí)，辛酸乙酯的物質(zhì)量是辛酸的2～3倍，而乙酸苯乙酯的量遠(yuǎn)低于苯乙醇。由表3分析可見，不同酶制劑處理均促進(jìn)了辛酸和辛酸乙酯的生成，其中PEC處理促進(jìn)量最低，HU促進(jìn)辛酸的生成量最大，HU和PF顯著促進(jìn)了辛酸乙酯的生成，促進(jìn)量接近對(duì)應(yīng)糖苷水解最大生成量的3倍，說明酵母胞外酶處理主要是從促進(jìn)酵母酯代謝的角度促進(jìn)辛酸乙酯的生成，有利于葡萄酒相關(guān)酯類的生成。酶制劑處理也不同程度地促進(jìn)了發(fā)酵過程中苯乙醇的生成，增加量由大到小依次為PF、AR2000、HU、PEC，促進(jìn)量遠(yuǎn)大于對(duì)應(yīng)糖苷水解最大生成量。盡管乙酸苯乙酯含量遠(yuǎn)低于苯乙醇含量，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不難看出，優(yōu)選酵母胞外酶處理顯著增加了乙酸苯乙酯的含量，而PEC處理沒有促進(jìn)作用。本研究推斷，酶制劑處理促進(jìn)苯乙醇生成的作用主要是促進(jìn)了酵母合成苯乙醇的代謝，對(duì)應(yīng)糖苷前體的水解僅占其中一小部分，可以肯定優(yōu)選酵母胞外酶處理具有大幅促進(jìn)乙酸苯乙酯生成的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié) 論

辛酸乙酯和乙酸苯乙酯是葡萄酒中花香和果香的重要貢獻(xiàn)者，在本研究的模擬發(fā)酵體系中，二者的含量均呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)。酯類物質(zhì)在發(fā)酵后期的損失可能與發(fā)酵過程中CO2逸失有關(guān)[18]。本研究中，酶制劑處理在模擬發(fā)酵體系中均大幅增加了目標(biāo)香氣物質(zhì)的最終生成量，但大部分是促進(jìn)了酵母酯類代謝的生成量，這不僅與酶制劑中糖苷酶的活性有關(guān)，還可能與AR2000酶[24]、HU和PF中存在的酯酶、蛋白酶等有關(guān)。相比于AR2000酶和果膠酶，兩種非釀酒酵母胞外酶在促進(jìn)辛酸乙酯大幅生成之外，還極大促進(jìn)了乙酸苯乙酯生成，使乙酸苯乙酯的最終生成量達(dá)到了350～400 μg/L，超過了其在葡萄酒中的嗅覺閾值。因此非釀酒酵母胞外酶對(duì)辛酸乙酯和乙酸苯乙酯表現(xiàn)出更全面的促進(jìn)能力，更適合于葡萄酒的增香釀造。

兩種典型酯類物質(zhì)及其前體物質(zhì)在發(fā)酵過程中最大生成量來源的分析發(fā)現(xiàn)，辛基類(辛酸+辛酸乙酯)和苯基類(苯乙醇+乙酸苯乙酯)香氣物質(zhì)除來源于葡萄汁的純酒精發(fā)酵作用和酶制劑對(duì)香氣糖苷的水解外，還大量來源于酶制劑對(duì)酵母酯類代謝的促進(jìn)作用，添加香氣糖苷的水解產(chǎn)物僅在目標(biāo)香氣物質(zhì)生成量中占很小一部分。因此，優(yōu)選酵母胞外酶在葡萄汁發(fā)酵過程中促進(jìn)相關(guān)酯類香氣物質(zhì)生成的機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究揭示。

模擬葡萄汁發(fā)酵過程中，相比于AR2000和PEC，HU和PF促進(jìn)辛酸乙酯、辛酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇生成的效果更好。優(yōu)選酵母胞外酶對(duì)目標(biāo)酯類物質(zhì)促進(jìn)生成的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)酵母酯類物質(zhì)代謝的生成量上，對(duì)應(yīng)糖苷前體的水解僅占其中一小部分，所以優(yōu)選酵母胞外酶處理具有促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵過程中相關(guān)酯類物質(zhì)生成的增香應(yīng)用潛力。