雙拷貝tylD、tylF和tylJ弗氏鏈霉菌工程菌株構(gòu)建及其發(fā)酵性能研究

馬次郎 陳奕公 劉曉明 王文超 朱慧 蘇建宇,*

(1 寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2 寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

泰樂(lè)星(tylosin,Tyl)是一類(lèi)十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸用抗生素，其抗菌譜廣，在應(yīng)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌感染以及畜牧增產(chǎn)方面發(fā)揮了巨大作用，被廣泛應(yīng)用于獸藥及飼料添加劑。目前，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradie)是泰樂(lè)菌素的主要生產(chǎn)菌[1-3]。

弗氏鏈霉菌泰樂(lè)菌素生物合成基因簇(tylgene cluster)從抗性基因tlrB延伸至tlrC，共有85kb，含43個(gè)ORFs提供泰樂(lè)菌素合成所需完整的結(jié)構(gòu)基因[4]，分為tylIBA區(qū)域，tylLM區(qū)域，tylG區(qū)域，tylCK區(qū)域和tylEDHFJ等5個(gè)主要區(qū)域[5]。tylJ、tylD和tylF位于tylEDHFJ區(qū)域，其中tylJ和分別編碼TDP-脫氧己糖3-差向異構(gòu)酶(TDP-deoxyhexose 3-epimerase)和TDP-脫氧己糖4-酮基還原酶(TDP-deoxyhexose 4-ketoreductase)，催化TDP-4-酮基，6-脫氧葡萄糖(TDP-4-keto,6-deoxyglucose)轉(zhuǎn)化為T(mén)DP-6-脫氧阿洛糖(TDP-6-deoxyallose)[6]。tylF編碼的大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(macrocin-O-methyltransferase,MOMT)催化大菌素轉(zhuǎn)化為泰樂(lè)菌素，是泰樂(lè)菌素生物合成中的關(guān)鍵限速酶[7]。

泰樂(lè)菌素的合成受各種結(jié)構(gòu)基因及多種相關(guān)酶調(diào)控，除主代謝通路以外，還存在著眾多的分支途徑[8]，在這個(gè)過(guò)程中會(huì)生成多種中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物(包括很多未知成分)，構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[9]。弗氏鏈霉菌合成泰樂(lè)菌素的代謝過(guò)程中，O-碳霉氨基糖泰樂(lè)內(nèi)酯(O-mycaminosyltylonolide,OMT)形成后有兩條代謝流，一條結(jié)合6-脫氧-D-阿洛糖糖基形成去甲基拉克亭霉素，另一條轉(zhuǎn)化為6-脫氧-D-阿洛糖泰樂(lè)菌素(demycinosyltylosin,DMT)，后者產(chǎn)生更多副產(chǎn)物，影響泰樂(lè)菌素的質(zhì)量。為削弱DMT的合成通路，可選擇增加6-脫氧-D-阿洛糖合成路徑上的兩個(gè)關(guān)鍵基因tylJ和tylD的拷貝數(shù)，以此來(lái)強(qiáng)化OMT到去甲基拉克亭霉素的合成轉(zhuǎn)化。大菌素甲基化轉(zhuǎn)化為泰樂(lè)菌素是泰樂(lè)菌素合成代謝中的關(guān)鍵限速步驟，增加編碼大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的tylF基因拷貝數(shù)可提升大菌素的轉(zhuǎn)化速率，在縮短發(fā)酵周期的同時(shí)提高泰樂(lè)菌素發(fā)酵水平[10]。綜合以上分析，采取倍增tylJ、tylD和tylF基因拷貝數(shù)的策略對(duì)弗氏鏈霉菌進(jìn)行分子改造，能夠?qū)崿F(xiàn)強(qiáng)化泰樂(lè)菌素主代謝流，減少發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物生成，提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量(純度)目的，獲得具有優(yōu)良發(fā)酵性狀的泰樂(lè)菌素工程菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

弗氏鏈霉菌工業(yè)菌株；E.coliDH5α，本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliET12567(pUZ8002)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所楊科遷教授惠贈(zèng)；pSET152質(zhì)粒，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)宋源教授惠贈(zèng)；pTYL02質(zhì)粒(pSET152衍生質(zhì)粒，含PermE)，本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，pH7.0(用于大腸埃希菌培養(yǎng))；高氏一號(hào)培養(yǎng)基(購(gòu)自青海海博生物科技有限公司)：用于弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)；MS培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇20，黃豆餅粉20，MgCl3·6H2O 4，瓊脂粉15，pH7.0(用于大腸埃希菌-弗氏鏈霉菌屬間結(jié)合轉(zhuǎn)移培養(yǎng))；TSBY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 5，pH7.0(用于弗氏鏈霉菌液體搖瓶發(fā)酵)。胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeast extract)購(gòu)自O(shè)xoid公司；D-甘露醇、瓊脂粉、溶菌酶購(gòu)自Sarloio公司。

1.2.2 抗生素

硫酸安普霉素和萘啶酮酸：購(gòu)自Sigma公司；泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品(1026U/mg)：購(gòu)自國(guó)家獸藥監(jiān)察所。

1.2.3 工具酶

EcoRI、BamHI、EcoRV購(gòu)自Fermentas公司。

1.3 目的基因的獲得

根據(jù)插入片段的堿基序列使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6分別設(shè)計(jì)PermE、tylF-tylJ、tylD的引物，其中在PermE的上下游引物兩端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI，在tylF-tylJ的上下游引物兩端分別引入酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRV，在引物tylD的上下游引物兩端引入酶切位點(diǎn)EcoRV，并在tylFtylJ、tylD的上游引物上分別添加了核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal binding site,RBS)(表1)。分別以pTYL02質(zhì)粒DNA和弗氏鏈霉菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得所需目的基因片段。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建

首先將PermE基因片段與載體pSET152連接，得到重組質(zhì)粒pSET152-PermE，對(duì)其進(jìn)行EcoRV與BamHI雙酶切，然后將tylF-tylJ基因片段與重組質(zhì)粒pSET152-PermE連接，得到重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ，然后對(duì)其進(jìn)行EcoR V單酶切。為防止發(fā)生載體自連，單酶切回收后的載體用去磷酸化酶進(jìn)行處理，然后與tylD基因片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD(圖1)。

圖1 pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD

重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coliET12567中，涂布 LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單菌落接入新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，提取其質(zhì)粒，使用表1中引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。

1.5 表達(dá)載體的結(jié)合轉(zhuǎn)移及重組菌株的篩選

重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliET12567菌株，涂布LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選。篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接入新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證后的重組E.coliET12567菌株與弗氏鏈霉菌的預(yù)萌發(fā)孢子液(受體菌)混合涂布在MS培養(yǎng)基平板上，通過(guò)大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移，將pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉(zhuǎn)入弗氏鏈霉菌出發(fā)菌株內(nèi)，得到弗氏鏈霉工程菌株FJD。

1.6 弗氏鏈霉菌工程菌株驗(yàn)證

隨機(jī)選取30個(gè)工程菌株單菌落，分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，以出發(fā)菌株為對(duì)照，28℃、200r/min搖瓶發(fā)酵7d，測(cè)定發(fā)酵液泰樂(lè)菌素效價(jià)。

工程菌株FJD接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200r/min搖瓶發(fā)酵48h，取樣，以15%接種量接入新的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。連續(xù)傳代10代后，收集菌體，提取基因組DNA，卡那霉素和安普霉素抗性驗(yàn)證工程菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性。

1.7 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達(dá)分析

以rpoB作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCT值法[11]，對(duì)工程菌株tylD、tylF、tylJ基因相對(duì)于出發(fā)菌株對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量進(jìn)行qPCR分析。

1.8 泰樂(lè)菌素效價(jià)測(cè)定

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱(chēng)取泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配制400、500、600和700μg/mL的泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；分別吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L HCl定容，得到12、16、20、24和28μg/mL的泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)液，往復(fù)顛倒搖勻靜置；290nm下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液吸光度A值(0.1mol/L HCl為參比)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)，A值為橫坐標(biāo)，繪制泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

1.8.2 發(fā)酵液泰樂(lè)菌素效價(jià)測(cè)定

取50mL發(fā)酵液，加入2mL 20% Al2(SO4)3溶液進(jìn)行絮凝，過(guò)濾；取過(guò)濾液，根據(jù)預(yù)估效價(jià)對(duì)濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)晃?mL稀釋液于25mL容量瓶?jī)?nèi)，加入0.1mol/L HCl定容，往復(fù)顛倒混勻；290nm下測(cè)A值(0.1mol/L HCl為參比)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線表結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算發(fā)酵液中泰樂(lè)菌素含量。

泰樂(lè)菌素效價(jià)(U/mL)=測(cè)試樣品泰樂(lè)菌素含量(μg/mL)×1.026，式中1.026為根據(jù)泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品確定的效價(jià)/質(zhì)量換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證，分別得到了與預(yù)期大小一致的tylF～tylJ片段(1434bp)和tylD(1026bp)片段，表明重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD構(gòu)建成功(圖3)。

2.2 弗氏鏈霉菌FJD工程菌株泰樂(lè)菌素發(fā)酵效價(jià)

出發(fā)菌株與30株工程菌株泰樂(lè)菌素?fù)u瓶發(fā)酵效價(jià)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，隨機(jī)選取的30株工程菌中，20株泰樂(lè)菌素發(fā)酵效價(jià)高于出發(fā)菌株，其中最高的1株發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株提高了28.1%，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

圖2 泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of tylosin

圖3 重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pSET152-PermEtylF-tylJ-tylD

表2 30株工程菌與出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵效價(jià)Tab.2 Shaking flask fermentation potency of 20 engineering strains and initial strain

2.3 工程菌株的穩(wěn)定性

pSET152質(zhì)粒不含鏈霉菌復(fù)制起始位點(diǎn)。重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD通過(guò)大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移至弗氏鏈霉菌后，如沒(méi)有整合到染色體上，將不能在弗氏鏈霉菌中復(fù)制，從而在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中丟失，工程菌也因此喪失質(zhì)粒所攜帶的卡那霉素和安普霉素抗性。 以搖瓶效價(jià)最高的1株工程菌株為供試菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次后，工程菌在安普霉素抗性平板上生長(zhǎng)良好，與對(duì)照的無(wú)抗生素平板上生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有差異，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)穩(wěn)定的整合在弗氏鏈霉菌染色體上。

2.4 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達(dá)分析

將工程菌株目的基因CT值用對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因rpoB的CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用ΔΔCT法計(jì)算tylD、tylF和tylJ在弗氏鏈霉菌出發(fā)菌株中的相對(duì)表達(dá)，并以出發(fā)菌株中相應(yīng)目的基因的表達(dá)水平為參照，計(jì)算工程菌中tylD、tylF和tylJ的相對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果如圖4～6。

在168h的發(fā)酵周期中，工程菌tylD的表達(dá)較出發(fā)菌株均有提高，其中24h時(shí)工程菌tylD的表達(dá)水平為出發(fā)菌株的1.26倍，72h時(shí)達(dá)到出發(fā)菌株的2倍，并一直保持較高的表達(dá)水平。

圖4 工程菌株tylD基因相對(duì)于出發(fā)菌株的表達(dá)量Fig.4 Expression of tylD gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖5 工程菌株tylF基因相對(duì)于出發(fā)菌株的表達(dá)量Fig.5 Expression of tylF gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖6 工程菌株tylJ基因相對(duì)于出發(fā)菌株的表達(dá)量Fig.6 Expression of tylJ gene of engineering strain relative to that of initial strain

發(fā)酵24h時(shí)tylF表達(dá)量與出發(fā)菌株一致(相對(duì)表達(dá)量為1)，發(fā)酵48h時(shí)tylF相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始升高，至96h時(shí)達(dá)到最高水平，約為出發(fā)菌株的2.18倍，并在之后發(fā)酵過(guò)程中始終保持較高的表達(dá)量。

整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中工程菌tylJ的表達(dá)量始終高于出發(fā)菌株，其中發(fā)酵前期工程菌tylJ基因表達(dá)量顯著高于出發(fā)菌株，72h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到出發(fā)菌株的2.3倍，其后該基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，至發(fā)酵144h時(shí)，工程菌tylJ表達(dá)量保持在出發(fā)菌株表達(dá)量的1.4倍左右(表3)。

qPCR分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的tylD、tylF和tylJ基因在弗氏鏈霉菌中均得到有效的表達(dá)，工程菌中上述3個(gè)基因的表達(dá)水平均高于出發(fā)菌株。

3 討論

增加合成代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的拷貝數(shù)是鏈霉菌代謝工程育種的有效手段[12]。范亮等[13]構(gòu)建了具有雙拷貝tylF基因的泰樂(lè)菌素基因工程菌，其泰樂(lè)菌素?fù)u瓶發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌提高了32.7%。由于泰樂(lè)菌素合成代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，增加tylF的拷貝數(shù)能降低發(fā)酵產(chǎn)物中中間代謝產(chǎn)物大菌素的含量，提高泰樂(lè)菌素的產(chǎn)量，但無(wú)法降低DMT等發(fā)酵副產(chǎn)物(雜質(zhì))的積累。本研究針對(duì)泰樂(lè)菌素生產(chǎn)中組分轉(zhuǎn)化及主要副產(chǎn)物產(chǎn)生情況，在對(duì)弗氏鏈霉菌泰樂(lè)菌素代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析的基礎(chǔ)上，選擇碳霉糖合成路徑上的兩個(gè)關(guān)鍵基因tylD與tylJ以及泰樂(lè)菌素合成途徑中關(guān)鍵的限速酶基因tylF，構(gòu)建具有雙拷貝tylD、tylJ和tylF的弗氏鏈霉菌工程菌株，以達(dá)到調(diào)整并強(qiáng)化泰樂(lè)菌素的主合成代謝通路，提高抗生素產(chǎn)量，減少DMT等發(fā)酵副產(chǎn)物的目的。

表3 發(fā)酵過(guò)程中工程菌株tylD、tylF和tylJ基因表達(dá)特性Tab.3 Expression characteristics of tylD,tylF and tylJ in engineering strains during fermentation

在工業(yè)生產(chǎn)鏈霉菌工程菌株的構(gòu)建中，整合型質(zhì)粒的運(yùn)用以及最適啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)節(jié)對(duì)鏈霉菌合成目的產(chǎn)物有極大的促進(jìn)作用[14-17]。本研究以弗氏鏈霉菌基因組DNA為模版，克隆得到目的基因tylD和tylF-tylJ；使用整合型表達(dá)載體pSET152和組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PermE，保證發(fā)酵過(guò)程中工程菌的穩(wěn)定性，強(qiáng)化多拷貝的tylF、tylJ以及tylD的表達(dá)；tylF、tylJ采用自身RBS序列，tylD自身的RBS位于tylHII內(nèi)，其序列經(jīng)分析不符合最佳的RBS堿基排列，而tylHII的RBS序列滿足理想RBS堿基排列的條件，因此將tylHII的RBS序列與tylD的CDS序列銜接，調(diào)轉(zhuǎn)插入整合型質(zhì)粒中。采用上述構(gòu)建策略，最終得到一株弗氏鏈霉菌工程菌株，其發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株提高了28.1%，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)，該菌株發(fā)酵過(guò)程中tylF、tylJ、tylD表達(dá)量較出發(fā)菌株有明顯提高，可望作為優(yōu)良生產(chǎn)菌種用于泰樂(lè)菌素的發(fā)酵生產(chǎn)。