馮莉 王曉華 白瑞芳 周燕 董弘 冀小平

熒光原位雜交技術(shù)(flourescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是將分子生物探針與染色體特定位點結(jié)合來檢測染色體異常的一類技術(shù)。在上世紀80年代中期，D’Alton等[1]應(yīng)用FISH技術(shù)檢測到間期細胞核中數(shù)目異常的染色體。理論上FISH技術(shù)可以檢測所有染色體數(shù)目異常，由于13、18、21號以及X、Y染色體發(fā)生非整倍體畸變的頻率較高，占所有染色體病的65%～80%，因此設(shè)計這五條染色體的探針將其應(yīng)用到產(chǎn)前診斷中可以快速檢測常見染色體非整倍體畸變，易于普及，并具有一定臨床應(yīng)用價值。

對象與方法

1. 研究對象：本研究對象來源于2015年1月—2017年6月期間在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進行產(chǎn)前診斷的孕婦。孕婦年齡分布為18～46歲，平均年齡(33.0±5.8)歲；孕周大多集中在22周左右，其中最小孕周為17周+1天，最大33周。

2 .實驗方法：采集篩查高風險、超聲提示胎兒異常以及高齡孕婦的羊水199例，進行核型分析及FISH檢測。

(1)染色體核型分析實驗方法：離心收獲羊水細胞，加入5 ml培養(yǎng)液，分裝入兩個培養(yǎng)瓶中，在37℃溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7～8天后換液。在第10～12天，鏡檢細胞群落長勢良好，則加入秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h；處理后取出培養(yǎng)瓶，加入EDTA胰酶消化。收集培養(yǎng)后羊水細胞進行低滲、固定再處理、滴片、烤片后進行染色體鏡檢。

(2)FISH檢測實驗方法：玻片樣本處理，探針雜交，洗片，DAPI染色。閱片：熒光顯微鏡下隨機計數(shù)50個強信號且無重疊的雜交細胞。結(jié)果判讀：鏡下閱片若大于90%的核型顯示非整倍體信號則判斷為異常。若10%～60%的核型顯示非整倍體信號則判斷為嵌合體。如果無法判斷則擴大計數(shù)100個細胞。

3.實驗主要儀器及試劑：實驗主要儀器有熒光原位雜交系統(tǒng)，染色體分析系統(tǒng)，培養(yǎng)箱。實驗主要試劑為DNA FISH探針(北京金菩嘉公司18、X、Y、21、13五色探針)。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析：使用SSPS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用百分數(shù)或者率(%)表示。

結(jié)果

1. 染色體核型分析結(jié)果：進行產(chǎn)前診斷的主要為血清學篩查高風險、無創(chuàng)篩查高風險、高齡以及超聲異常等病例，本研究中共檢測出染色體非整倍體63例，占總檢測數(shù)的31.7%。具體各組染色體異常情況見表1。

2. 染色體異常分類情況對比分析：對所有研究對象進行染色體核型分析和FISH檢測發(fā)現(xiàn)，有2例染色體核型分析未檢測到異常，而FISH檢測結(jié)果為21-三體。13-三體和18-三體檢測結(jié)果FISH與核型分析完全一致。性染色體異常組FISH漏診1例核型為47，XXY，F(xiàn)ISH檢測為兩個X信號，未發(fā)現(xiàn)Y信號，標本狀態(tài)顯示血性羊水，考慮為母血污染。在結(jié)構(gòu)異常組，核型分析為羅氏易位型13-三體及21-三體的樣本均成功檢測。FISH探針采用的是特異位點探針和著絲粒探針，1例18號染色體短臂的部分缺失由于不是本研究檢測的目標區(qū)域，未成功檢測。1例9號多態(tài)、1例嵌合體漏診。核型分析正確率為96.9%(63/65)，F(xiàn)ISH檢測正確率為93.8%(61/65)，結(jié)果見表2。

表1 染色體核型結(jié)果分析

表2 五色探針檢測情況分析

3. 核型分析染色體結(jié)構(gòu)異常6例情況及兩種檢測方式漏檢、培養(yǎng)失敗情況分析：兩種檢測方式不一致的病例詳情見表3。核型分析結(jié)果為結(jié)構(gòu)異常的6例病例，均不在FISH檢測探針設(shè)計范圍之內(nèi)。但是其中核型分析為羅氏易位的FISH結(jié)果與核型結(jié)果一致。同時由于FISH技術(shù)不能準確檢測嵌合體，故漏檢1例。染色體核型分析培養(yǎng)失敗的3例均經(jīng)FISH檢測成功。

表3 核型分析結(jié)構(gòu)異常、核型培養(yǎng)失敗及FISH漏檢情況

討論

1. FISH檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用方面的優(yōu)勢：目前，依賴于G顯帶的染色體核型分析技術(shù)仍是染色體疾病診斷的“金標準”，可以準確地檢出染色體非整倍體，也可以檢測一定范圍的結(jié)構(gòu)異常。但受到自身技術(shù)的局限仍有一些不足之處，診斷周期長，對孕周要求嚴，實驗失敗率高等[3]。

本研究中的199例羊水標本培養(yǎng)時間范圍在14～28 d不等，平均檢測時間在21 d左右，最長1例培養(yǎng)時間為31 d。核型培養(yǎng)失敗3例，培養(yǎng)成功率為98.5%。發(fā)放報告時間在24～48 h內(nèi)。研究中，培養(yǎng)失敗的3例孕婦均拒絕進行二次羊水穿刺，經(jīng)FISH檢測，2例胎兒診斷為21-三體，1例胎兒正常。由于FISH技術(shù)是用已知核酸序列作為探針與靶DNA進行原位雜交，觀察熒光信號進行診斷，降低了實驗操作與結(jié)果分析的難度[4]。Choolani M等[5]認為當羊水細胞難以培養(yǎng)時，在檢測量大的實驗室可以應(yīng)用FISH代替核型分析來檢測染色體異常。

2. FISH可以準確檢測染色體非整倍體：FISH檢測技術(shù)具有良好的實用性，靈敏度和特異性分別可達99.9%和100%[6]。由于在目前所有的染色體非整倍體畸變中，21、18、13號及性染色體非整倍體發(fā)病率約占65%～80%[7]，檢測這幾類常見染色體數(shù)目，可滿足部分產(chǎn)前診斷的需要。本研究檢出65例異常結(jié)果，1例9號多態(tài)、1例18號短臂缺失和1例嵌合體外，余下62例(95.4%)均為常見染色體非整倍體。

3. FISH技術(shù)目前存在的一些局限性：一般認為，F(xiàn)ISH技術(shù)難以檢出嵌合體。嵌合體患兒體內(nèi)嵌合細胞比例，將決定雜交信號的檢出率。對于較小的嵌合體，F(xiàn)ISH難以做出精確判斷，必須結(jié)合核型分析結(jié)果來全面判斷。FISH也不能進行探針設(shè)計目標結(jié)構(gòu)區(qū)外異常的檢測。因此在產(chǎn)前診斷過程中要把握好應(yīng)用指征，準確定位，與核型分析的結(jié)果相互補充。

綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)在產(chǎn)前遺傳性疾病檢測中，可以對常見染色體非整倍體進行準確的檢測?？梢耘c核型分析互為補充，為臨床提供更全面的服務(wù)。