劉雪嬌 賈田惠 高同國 郭曉軍 李術(shù)娜

摘要：對貝萊斯芽孢桿菌電擊轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，以期建立其高效轉(zhuǎn)化體系。采用pIC333質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化貝萊斯芽孢桿菌3A3-15野生型菌株，考察細(xì)胞生長階段、電壓、電阻和質(zhì)粒DNA加入量對轉(zhuǎn)化效率的影響。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物D600 nm為0.9，電壓為1.75 kV，電阻為400 Ω，質(zhì)粒DNA加入量為50 ng時(shí)，其轉(zhuǎn)化率最高達(dá)7.92×104 CFU/μg。該研究為貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15菌株的基因和分子水平操作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌;電擊轉(zhuǎn)化;pIC333;優(yōu)化

中圖分類號： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0046-04

收稿日期：2017-12-15

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金（編號：C2015204031）;河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：BJ2016029）。

作者簡介：劉雪嬌（1991—），女，河北廊坊人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：956760741@qq.com。

通信作者：高同國，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：gtgrxf@163.com。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是一類重要的生防細(xì)菌[1]，對大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、瘡痂鏈霉菌、立枯絲核菌等多種植物病原菌有明顯抑菌作用[2]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的進(jìn)步，利用基因工程手段對生防細(xì)菌改造以提高其生防效果成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題，但由于芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁厚而致密[3]，其基因轉(zhuǎn)化效率較低[4]。因此，建立并優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌基因轉(zhuǎn)化體系是對其進(jìn)行分子操作的重要前提。

在大量的分子遺傳研究方法中，轉(zhuǎn)座子隨機(jī)誘變技術(shù)因操作簡便而備受關(guān)注，轉(zhuǎn)座子及其衍生物作為插入突變原或分子標(biāo)簽已廣泛應(yīng)用于基因的分離和克隆中[5]，特別是某些具有隨機(jī)轉(zhuǎn)化特性的轉(zhuǎn)座子，已成為發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因、發(fā)掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具[6]。Tn10轉(zhuǎn)座元件是目前在芽孢桿菌中應(yīng)用廣泛的轉(zhuǎn)座子之一，已成功應(yīng)用于芽孢桿菌突變體庫的構(gòu)建及基因功能的研究，mini-Tn10是目前應(yīng)用比較成熟、廣泛的Tn10轉(zhuǎn)座子衍生物之一[7]。而轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pIC333是針對芽孢桿菌構(gòu)建出來的改良的mini-Tn10載體[8-9]。

目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡懈惺軕B(tài)法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。其中，電擊轉(zhuǎn)化法由于操作簡單、轉(zhuǎn)化率相對較高而被廣泛使用。該方法已在枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短芽孢桿菌等不同種芽孢桿菌上得到成功應(yīng)用[10-12]。芽孢桿菌不同種屬間，電轉(zhuǎn)化條件對電轉(zhuǎn)效率的影響較大，導(dǎo)致不同細(xì)菌電擊轉(zhuǎn)化效率不同。如細(xì)胞生長D600 nm值為0.7、pHY-P43質(zhì)粒DNA加量為80 ng、恢復(fù)培養(yǎng)基山梨醇濃度為0.8 mol/L、電轉(zhuǎn)緩沖液為SGM以及電場強(qiáng)度為21 kV/cm時(shí)枯草芽孢桿菌WB600轉(zhuǎn)化率為8.0×106 CFU/μg [13]，Tn5轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入短小芽孢桿菌DX01菌株時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)液D600 nm為0.96時(shí)，電壓2.4 kV/cm，采用AEB電轉(zhuǎn)緩沖液時(shí)電轉(zhuǎn)效率最高587 CFU/μg[14]。目前電轉(zhuǎn)化方法在枯草芽孢桿菌中研究較多，但很少有關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系的研究。

前期工作中篩選得到1株對尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌3A3-15，為進(jìn)一步開展其分子遺傳學(xué)研究，對其影響電擊效率的因素進(jìn)行了摸索并對其電擊轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基?本試驗(yàn)于2016年12月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

貝萊斯芽孢桿菌3A3-15菌株為上述實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

質(zhì)粒pIC333由江蘇師范大學(xué)劉偉杰老師提供，該質(zhì)粒帶有轉(zhuǎn)座子mini-Tn 10，含有壯觀霉素抗性基因、紅霉素抗性基因和ColE1復(fù)制起點(diǎn)。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，pH 值為7.2～7.5。

生長培養(yǎng)基：LB+0.5 mol/L山梨醇。

復(fù)蘇培養(yǎng)基：LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L甘露醇。

電擊緩沖液：0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌3A3-15生長曲線

用竹簽挑取活化好的貝萊斯芽孢桿菌3A3-15，接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，再按1%的接種量接種到新鮮的生長培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測定樣品在600 nm波長下的吸光度，并繪制生長曲線。

1.3 質(zhì)粒提取與感受態(tài)細(xì)胞制備

采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取結(jié)果進(jìn)行檢測，采用Thermo Scientific公司的Nanodrop 2000分光光度計(jì)測定其濃度及純度。貝萊斯芽孢桿菌3A3-15菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)[15-16]中的制備方法。取出冰箱中保存的3A3-15菌株，采用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化。挑取單菌落接種于6 mL LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、200 r/min搖床，過夜培養(yǎng)。取5.2 mL接入100 mL含0.5 mol/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)。將菌液冰浴10 min，然后4 ℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體。用100 mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基重新懸浮菌體，4 ℃、5 000 r/min離心8 min棄上清，如此漂洗至少4次。將洗滌后的菌體吹懸于1 mL電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，每預(yù)冷的1.5 mL EP管分裝100 μL，置于-70 ℃保存。

1.4 電擊轉(zhuǎn)化條件

在100 μL感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒DNA，冰上孵育30 min后，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（2 mm）中，電擊1次。利用浙江寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)的SCIENTZ-2C基因?qū)雰x進(jìn)行電擊，電擊完成后迅速取出杯子并立即加入900 μL RM，37 ℃、100 r/min復(fù)蘇5 h后，吸取100 μL涂布在含有100 μg/mL壯觀霉素和5 μg/mL紅霉素的LB平板上。30 ℃培養(yǎng)48 h。記錄菌落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化1 μg質(zhì)粒獲得的菌落數(shù)）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)菌生長期對轉(zhuǎn)化率的影響

為考察貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15不同的生長狀態(tài)對感受態(tài)的制備和后期轉(zhuǎn)化的影響，培養(yǎng)細(xì)胞D600 nm值分別為03、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5時(shí)，按照“1.3”節(jié)方法制備成不同生長時(shí)期的電轉(zhuǎn)感受態(tài)，并于電壓1.25 kV、電容25 μF、電阻400 Ω條件下，電擊持續(xù)時(shí)間應(yīng)在4.5～5.0 ms之間。電擊轉(zhuǎn)化方法參考“1.4”節(jié)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 電壓對轉(zhuǎn)化率的影響

電場強(qiáng)度過高會造成細(xì)胞的大量死亡，電場強(qiáng)度過低則不能形成細(xì)胞穿孔[17]。本試驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，選擇轉(zhuǎn)化率最高的細(xì)胞生長期，研究電壓為1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 kV時(shí)對轉(zhuǎn)化率的影響。其他條件如電容25 μF、電阻400 Ω等保持不變，按照上述“1.4”節(jié)方法進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 電阻對轉(zhuǎn)化率的影響

對芽孢桿菌的電擊轉(zhuǎn)化電阻大多采用200 Ω和 400 Ω[18-19]。在上述細(xì)胞生長期和轉(zhuǎn)化電壓確定后，比較了電阻為200 Ω和400 Ω對貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15菌株電擊轉(zhuǎn)化率的影響。按照上述“1.4”節(jié)方法進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，其中電容25 μF保持不變，轉(zhuǎn)化后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 質(zhì)粒加入量對轉(zhuǎn)化的影響

電轉(zhuǎn)化效率與外源DNA量在一定范圍內(nèi)成正比;但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，則會使轉(zhuǎn)化效率下降[20]。試劑盒提取pIC333質(zhì)粒后，根據(jù)前述已優(yōu)化的其他電擊條件，在電擊轉(zhuǎn)化中分別加入5、10、50、100、500 ng的質(zhì)粒DNA，按照“1.4”節(jié)方法進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.9 轉(zhuǎn)化子分子驗(yàn)證

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，于含有100 μg/mL壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12h后，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用Tn10F：5′-GCATTAATGAATCGGCCAACG-3′和Tn10R：5′-GTGGGTAAACCGTGAATATCG-3′引物對含有的壯觀霉素基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用紅霉素引物ermF：5′-ATG AACGAGAAAAATATAAAACAC-3′和ermR：5′-TTACTTA TTAAATAATTTATAGCTATT-3′對紅霉素編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

壯觀霉素基因PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

紅霉素基因PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，25 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒提取結(jié)果

采用試劑盒提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳對質(zhì)粒進(jìn)行檢測（圖1）。質(zhì)粒條帶較清晰且無其他條帶說明提取的質(zhì)粒可直接用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中。經(jīng)nanodrop 2000分光光度計(jì)測定其濃度為34.1 ng/μL，其D260 nm/D280 nm=2.1，D260 nm/D230 nm=2.24，表明提取的質(zhì)粒濃度及純度滿足電轉(zhuǎn)化的需要。

2.2 細(xì)菌生長期對轉(zhuǎn)化率的影響

采用分光光度計(jì)測定3A3-15菌株的生長曲線，結(jié)果見圖2。根據(jù)生長曲線，選取不同生長階段的3A3-15培養(yǎng)物制備成電擊感受態(tài)細(xì)胞，研究不同生長階段的細(xì)胞制備的感受態(tài)對3A3-15轉(zhuǎn)化效率的影響。如圖3所示，在D600 nm=0.3～0.9時(shí)，3A3-15處于對數(shù)生長前期，轉(zhuǎn)化率隨細(xì)胞數(shù)量的增多逐漸增加。當(dāng)D600 nm值為0.9時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，為172×104 CFU/μg，隨后其轉(zhuǎn)化率隨培養(yǎng)時(shí)間延長有所降低。

2.3 電壓對3A3-15菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

電場強(qiáng)度是影響電擊轉(zhuǎn)化效率的重要參數(shù)[21]。根據(jù)上述結(jié)果，用D600 nm=0.9的3A3-15培養(yǎng)物做電擊感受態(tài)， 研

究不同電壓下3A3-15菌株電擊轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖4。當(dāng)電壓為1.25～1.75 kV時(shí)，3A3-15菌株的轉(zhuǎn)化率有明顯的上升，電壓為1.75 kV時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到了5.33×104 CFU/μg;之后隨著電壓的增大，其轉(zhuǎn)化率有所下降。

2.4 電阻對3A3-15菌株電轉(zhuǎn)化效率的影響

在電壓為1.75 kV條件下，測試電阻值在200 Ω和 400 Ω 時(shí)3A3-15菌株的電擊轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖5，在電壓為 1.75 kV、電阻值為200 Ω和400 Ω的條件下電擊轉(zhuǎn)化效率分別為3.23×104 CFU/μg和5.50×104 CFU/μg。故后續(xù)試驗(yàn)電擊過程采用400 Ω電阻值。

2.5 質(zhì)粒DNA加入量對3A3-15電轉(zhuǎn)化效率的影響

在已優(yōu)化的電擊條件的基礎(chǔ)上，研究pIC333質(zhì)粒加入量對3A3-15菌株電擊轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果（圖6）表明，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著加入質(zhì)粒DNA量的增加，其電擊轉(zhuǎn)化效率有所增加，當(dāng)加入量為50 ng時(shí)，其轉(zhuǎn)化率最高，為7.92×104 CFU/μg。當(dāng)質(zhì)粒DNA的加入量再增加時(shí)轉(zhuǎn)化率反而降低。

2.6 貝萊斯芽孢桿菌3A3-15轉(zhuǎn)化子檢測

將pIC333質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15的感受態(tài)細(xì)胞中后，篩選得到了轉(zhuǎn)化子3A3-15-PIC333，提取該轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，利用PCR擴(kuò)增壯觀霉素基因進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示。利用Tn10F和Tn10R引物擴(kuò)增其壯觀霉素編碼基因，沒有轉(zhuǎn)化的野生型3A3-15中沒有目的條帶，轉(zhuǎn)化子中得到了大小約為2.1 kb的片段。上述PCR產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果與壯觀霉素基因序列一致。進(jìn)一步利用引物ermF和ermR對其編碼的紅霉素基因進(jìn)行擴(kuò)增，野生型3A3-15中沒有擴(kuò)增到相關(guān)基因片段，在轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增得到大小約750 bp的片段，經(jīng)測序、比對，其與紅霉素基因序列一致。上述檢測結(jié)果說明，PIC333質(zhì)粒已經(jīng)通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入了貝萊斯芽孢桿菌3A3-15中。

3 討論與結(jié)論

電轉(zhuǎn)化是一種簡便高效的外源DNA轉(zhuǎn)化的方法，因菌種不同其轉(zhuǎn)化效率差別較大，相對于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚且致密，電擊轉(zhuǎn)化率較低[2]。而且芽孢桿菌不同的種屬、質(zhì)粒攜帶復(fù)制子不同來源，其電轉(zhuǎn)化效率差別較大。王培培等比較了5個(gè)不同大小和攜帶不同復(fù)制子來源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌NCD-2菌株的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)粒大小與轉(zhuǎn)化效率之間無線性關(guān)系，但不同復(fù)制子來源的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)效率差別很大，質(zhì)粒pHV1249的電轉(zhuǎn)化效率為1.40×102 CFU/μg，而pNW33N的電轉(zhuǎn)化效率為2.38×104 CFU/μg [10]。質(zhì)粒pNW33N電轉(zhuǎn)化凝結(jié)芽孢桿菌P4-102B的最高轉(zhuǎn)化率為2.7×102 CFU/μg [11]。質(zhì)粒pHT43電轉(zhuǎn)化多黏類芽孢桿菌JSa-9感受態(tài)細(xì)胞和原生質(zhì)體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率分別為0.36×103 CFU/μg和 1.0×103 CFU/μg [17]。本試驗(yàn)中質(zhì)粒pIC333電轉(zhuǎn)化貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為7.92×104 CFU/μg，滿足基因操作的需要。

電場強(qiáng)度是影響電擊效率的主要參數(shù)，提高電場強(qiáng)度可以增強(qiáng)外源基因進(jìn)入菌體的概率，但會增加細(xì)菌細(xì)胞的死亡率，使得轉(zhuǎn)化效率下降，因此轉(zhuǎn)化效率要兼顧這2個(gè)方面。不同的菌株所需最適的轉(zhuǎn)化電場強(qiáng)度有所不同。如Lu等研究了質(zhì)粒pHT43在2株枯草芽孢桿菌WB800和DB104中的轉(zhuǎn)化率，發(fā)現(xiàn)在20～25 kV/cm的電場強(qiáng)度下，2株芽孢桿菌最優(yōu)轉(zhuǎn)化強(qiáng)度有所不同，分別在24 kV/cm和22 kV/cm時(shí)電擊轉(zhuǎn)化率最高[22]，枯草芽孢桿菌NCD-2最適轉(zhuǎn)化場強(qiáng)為 14 kV/cm [10]。迄今，除本研究外未發(fā)現(xiàn)有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌優(yōu)化電場強(qiáng)度的報(bào)道。

不同菌株電擊轉(zhuǎn)化的最佳生長階段是不一致的。一般處于對數(shù)生長初期的菌株電擊轉(zhuǎn)化率高于中期和后期[16]。本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化率最高時(shí)其D600 nm為0.9，處于對數(shù)生長初期。外源質(zhì)粒DNA加入量對轉(zhuǎn)化也有一定影響，加入量不足和太多都會影響轉(zhuǎn)化效率。本試驗(yàn)中DNA最佳加入量為50ng，這與牛福星等發(fā)現(xiàn)pHCMC04質(zhì)粒添加量為140 ng時(shí)其轉(zhuǎn)化率最高的結(jié)果[23]以及Zhang等發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒DNA含量在10 ng時(shí)pHT43轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis ZK的效率最高的結(jié)果[24]均有所不同，說明不同菌株間轉(zhuǎn)化所需DNA濃度有所不同。

總之，本試驗(yàn)首次研究了pIC333電轉(zhuǎn)化貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物濃度D600 nm為0.9、電壓為1.75 kV，電阻為400 Ω、質(zhì)粒DNA加入量為50 ng時(shí)，其轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)7.92×104 CFU/μg，本研究結(jié)果為貝萊斯芽孢桿菌的電擊轉(zhuǎn)化提供了方法，為其基因轉(zhuǎn)移和分子生物學(xué)操作奠定了基礎(chǔ)。

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