黃勛和 趙雪敏 柯振華 陳龍星 李紀泰 段巖麗 鐘福生

摘要：應用微衛(wèi)星位點LEI0258研究我國烏骨雞的遺傳多態(tài)性與分子進化。以8種烏骨雞和4種黑羽雞為研究材料，通過基因分型與測序，構(gòu)建中介網(wǎng)絡圖，分析烏骨雞的遺傳多樣性并探討其起源。240份樣品共檢測到67個等位基因，片段長度為181～507 bp。烏骨雞保持著與黑羽雞相當?shù)倪z傳變異水平，觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.813、0.962、0.957。經(jīng)測序鑒定出38個等位基因，部分等位基因為個別烏骨雞品種所特有。10個等位基因與25種已知MHC血清型相匹配。基于側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡圖將38個等位基因分為6條進化枝，未發(fā)現(xiàn)烏骨雞特有的進化枝。研究結(jié)果為烏骨雞的保種選育與開發(fā)利用及起源進化研究提供了理論基礎。

關(guān)鍵詞：烏骨雞;微衛(wèi)星位點;LEI0258;多態(tài)性;進化

中圖分類號： S831.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0040-06

收稿日期：2017-11-07

基金項目：廣東省自然科學基金項目（編號：2014A030307018）;廣東省公益研究與能力建設項目（編號：2015A020208020、2016A030303068）;嘉應學院省市共建重點建設項目[編號：嘉院（2017）27號]。

作者簡介：黃勛和（1982—），男，廣東河源人，博士，副教授，主要從事家雞遺傳資源與進化研究。E-mail：hxh826@jyu.edu.cn。

通信作者：鐘福生，博士，教授，主要從事動物生產(chǎn)與畜牧工程。E-mail：zfs@jyu.edu.cn。

微衛(wèi)星位點LEI0258是近年來逐漸應用于家雞遺傳多樣性與分子進化的遺傳標記，與常規(guī)的微衛(wèi)星不同，LEI0258由R13（CTATGTCTTCTTT）和R12（CTTTCCTTCTTT）2個重復單元組成，同時側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)換、顛換或缺失等變異較多，因而該位點具有較高的多態(tài)性[1-6]。微衛(wèi)星位點LEI0258定位于雞16號染色體的主要組織相容性復合體B區(qū)域（major histocompatibility complex B region，MHC-B），其遺傳多態(tài)性通常與宿主的抗病能力呈正相關(guān)[7-8]，并且與MHC-B血清型有較好對應關(guān)系[9]。因此，微衛(wèi)星位點LEI0258對于評估保育群體的遺傳多樣性水平與保護潛力具有一定的參考價值。

烏骨雞是獨具中國特色的畜禽品種之一，因其特有的藥用價值和我國的飲食文化，在近千年的環(huán)境選擇及人工培養(yǎng)下，形成了近20個體型外貌、生產(chǎn)性能各異的地方品種[10]。微衛(wèi)星與線粒體DNA研究表明烏骨雞具有較高的遺傳多樣性水平[11-13]，而烏骨雞LEI0258多態(tài)性的研究尚屬空白。本研究在應用微衛(wèi)星位點LEI0258對我國主要烏骨雞品種進行遺傳多態(tài)性與分子進化分析，評估保育雞種的遺傳變異水平，探討烏骨雞的遺傳起源，為烏骨雞的保種選育與利用提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏骨雞（烏雞）及黑羽雞（非烏骨雞）樣品采自各自保種場，每個品種20羽（表1），翅下靜脈取血，終濃度70%的乙醇于-80 ℃保存，采用傳統(tǒng)的酚氯仿法提取基因組DNA，PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2? PCR擴增與基因分型

擴增引物序列參照McConnell等的序列[1]，正向引物5′端添加FAM熒光標記。PCR擴增體系為30 μL：3.0 μL 10×PCR buffer，2.4 μL dNTP mixture（2.5 mmol/L），上、下游引物（20.0 μmol/L）各0.3 μL，0.3 μL rTaq酶（5 U/μL），50～100 ng 模板DNA，滅菌ddH2O補齊至30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃延伸 1 min，38個循環(huán);72 ℃延伸7 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海翼和應用生物技術(shù)有限公司ABI 3730平臺進行基因分型。

1.3 等位基因測序

根據(jù)基因分型的結(jié)果，參照黃勛和等的方法[5]挑選測序樣品，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.4 統(tǒng)計分析

觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，HE）、多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）、等位基因數(shù)（NA）和等位基因頻率等由軟件Cervus 3.0.3[14]統(tǒng)計。為與黃羽雞[5]進行比較，應用軟件ADZE 1.0[15]對等位基因多態(tài)性進行稀釋處理。使用軟件MEGA 6.0[16]執(zhí)行序列比對。去掉重復序列后，使用軟件SplitsTree 4.10[17]構(gòu)建基于側(cè)翼序列的中介網(wǎng)絡圖（median-joining network），進化枝的命名參考Chazara等[2]和黃勛和等[5-6]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型多態(tài)性

240個樣品基因分型共檢測出67個等位基因，片段大小范圍為181～507 bp，頻率最高的是等位基因205，為0.104 2，其次是193（0.068 8）和310（0.064 6）（表2）。烏骨雞觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.813、0.962和0.957，與黑羽雞和黃羽雞相當，表明中國烏骨雞保持著較高的遺傳變異水平（表3）。其中，德化黑雞的多態(tài)信息含量最高（0.929），余干烏骨雞最低（0.809）。德化黑雞的等位基因豐度最高（14.389），黃羽烏雞最低（9.554）;江山烏骨雞的私有等位基因豐度最高（4.957），黃羽烏雞最低（1.014）。烏骨雞的等位基因豐度與私有等位基因豐度均高于黑羽雞和黃羽雞（表3）。

2.2 核苷酸序列分析

抽檢67個樣品進行雙向測序，共檢測出38個等位基因，片段大小在193～501 bp，其中10個為首次發(fā)現(xiàn)（表4）。3個等位基因與毛細管電泳分型結(jié)果一致，分別是193、205和237。微衛(wèi)星位點LEI0258由2個重復單元R13（CTATGTCTTCTTT）和R12（CTTTCCTTCTTT）組成，重復次數(shù)分別1～17次和3～28次。R13上游有55 bp（不含引物序列），含有8個變異位點，以轉(zhuǎn)換為主，但在-29～-30出現(xiàn)了“TT”缺失的現(xiàn)象。R12下游有53 bp（不含引物序列），含有5個變異位點，以顛換為主，5堿基位置出現(xiàn)了T/C轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象。部分等位基因出現(xiàn)下游11～18位置“ATTTTGAG”缺失的現(xiàn)象，但僅限于小于241 bp的等位基因。等位基因261在11～18突變?yōu)锳TTTTGGG，不同于Fulton等報道的“ATTTGAG”[9]，但與Han等[3]、黃勛和等[5-6]的報道相同。

2.3 側(cè)翼區(qū)中介網(wǎng)絡圖分析

去掉R13、R12重復序列后，構(gòu)建側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡圖（圖1）。38個等位基因可分為6條進化枝（A-F），每條進化枝有1～15個等位基因。其中，A枝的等位基因最多，為15個;E枝只含有1個等位基因。有些等位基因只出現(xiàn)在特定的烏骨雞品種，如419（德化黑雞）、421（金湖烏鳳雞）;而有些等位基因則分布在多個烏骨雞品種，如193、205、249和333。每條進化枝均有黃羽雞與烏骨雞共享的等位基因，其中A、B、C同樣存在于紅原雞中[2，9]。10個等位基因的血清型分別與25種MHC單倍型相對應，分布在A、B、D和E進化枝中，其中2個等位基因為黑羽雞特有（表4）。

3 討論與結(jié)論

烏骨雞是我國寶貴的家禽遺傳資源，具有重要的經(jīng)濟價值和科學研究價值。微衛(wèi)星位點是家雞品種保育效果動態(tài)監(jiān)測的重要遺傳標記[18-19]。微衛(wèi)星LEI0258遺傳變異分析顯示，烏骨雞保持著與黑羽雞相當?shù)倪z傳多樣性水平（表3），表明烏骨雞保育狀態(tài)較好，有利于后續(xù)的保種選育與開發(fā)利用。從期望雜合度、觀察雜合度和多態(tài)信息含量可以看出，與常規(guī)微衛(wèi)星相比，微衛(wèi)星LEI0258位點普遍具有較高的遺傳變異性[5-6]，這可能與所選研究樣本以及遺傳標記不同有關(guān)。

微衛(wèi)星位點LEI0258特異等位基因可作為品種鑒定的參考依據(jù)[3，5-6]。烏骨雞具有較高的營養(yǎng)價值，為提高生長生產(chǎn)性能和營養(yǎng)價值，各地開展了烏骨雞品種保種選育和新品系培養(yǎng)等工作。但市面上出現(xiàn)了許多良莠不齊的商品雞冒充地方烏骨雞品種，給鑒定工作帶來了極大的困擾。本研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)等位基因為個別品種所特有，如260（黃山黑雞）、308（金湖烏鳳雞）。將來還需加大研究樣品量以鑒定更多的品種特異等位基因，同時聯(lián)合其他分子標記[20-23]以及外貌特征開展品種鑒定檢測工作。

烏骨雞具有較強的環(huán)境適應能力，在我國大部分省份均有分布。MHC遺傳變異性通常與家禽抗病能力密切相關(guān)[24-26]，而微衛(wèi)星位點LEI0258等位基因與MHC單倍型有較強的相關(guān)性[9]。本研究根據(jù)已有材料整理了烏骨雞微衛(wèi)星位點LEI0258等位基因血清型與MHC單倍型的對應關(guān)系，后續(xù)還需開展烏骨雞MHC單倍型相關(guān)的試驗鑒定工作。

家雞馴化的起源地和時間迄今仍存在較大爭議[27-33]，基于側(cè)翼區(qū)的中介網(wǎng)絡圖反映了等位基因之間的關(guān)系[34]，對系統(tǒng)進化研究亦有一定的參考價值[5-6]。在烏骨雞所有的進化枝中，均存在與黑羽雞和黃羽雞共享的等位基因（圖1），烏骨雞難以從家雞中完全分離出來，提示烏骨雞可能是從家雞選育而來，但具體從哪些品種選育而來、具體選育時間等信息則需進一步研究。紅原雞也有部分等位基因分布于進化枝A、B和C中[2，9]，表明紅原雞是這些家雞的共同祖先。將來需要加大烏骨雞品種覆蓋度和樣品數(shù)量，從黑色素等特色基因全基因組角度探討烏骨雞的起源與擴散歷史。

致謝：感謝華南農(nóng)業(yè)大學張細權(quán)教授與何丹林高級實驗師、安徽農(nóng)業(yè)大學耿照玉教授、廣西大學夏中生教授與楊秀榮教授、江西省農(nóng)業(yè)科學院武艷平博士、山東農(nóng)業(yè)大學李顯耀教授提供樣品，以及廣東海洋大學杜炳旺教授、福建農(nóng)林大學李昂教授在采集樣品時提供的幫助。

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