徐劼 段德超

摘要：采用水培試驗(yàn)，研究不同濃度鎘（Cd）脅迫下Cd在芹菜不同器官組織中的積累及對(duì)芹菜生理生化指標(biāo)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，Cd濃度為40 mg/L時(shí)，芹菜葉、莖、根中的Cd含量相對(duì)最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/L;Cd濃度為10 mg/L時(shí)，芹菜對(duì)Cd的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力相對(duì)最強(qiáng)，富集系數(shù)、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別為5.83、0.62，同時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量處于最高水平;Cd脅迫導(dǎo)致芹菜葉片細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)模糊，輪廓不飽滿(mǎn)，淀粉顆粒增大、變多，葉綠體出現(xiàn)腫脹，且基粒類(lèi)囊體呈波浪狀，并處于解離狀態(tài)，而根尖細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)變稀，液泡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞核仁消失，染色質(zhì)外溢，線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹;Cd脅迫濃度分別為5、10、20、40 mg/L時(shí)，芹菜葉組織中的可溶性蛋白含量分別為清水處理（CK）的98.73%、96.55%、91.28%、86.16%，而根中的蛋白含量分別為對(duì)照的99.74%、109.98%、132.76%、157.18%;隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜的根系活力逐漸降低，與CK相比分別顯著下降15.33%、57.72%、58.69%、70.59%（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：芹菜;鎘;富集系數(shù);超微結(jié)構(gòu);生理特性;轉(zhuǎn)運(yùn)能力;細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)： X53;S636.301? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0095-04

收稿日期：2017-12-12

基金項(xiàng)目：浙江省嘉興市科技計(jì)劃（編號(hào)：2017BY18065）。

作者簡(jiǎn)介：徐 劼（1975—），男，遼寧遼陽(yáng)人，博士，講師，從事土壤重金屬植物污染化學(xué)與農(nóng)產(chǎn)品安全研究。Tel：（0573）83643295;E-mail：xujie1688@126.com。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)發(fā)展加快，環(huán)境的重金屬污染問(wèn)題日益凸顯。鎘（Cd）作為生物活性相對(duì)較高的金屬元素，移動(dòng)性強(qiáng)、毒性大，且極易被農(nóng)作物吸收，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅，會(huì)產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等效應(yīng)[1]。Cd作為生物毒性最強(qiáng)的重金屬之一[2]，其引起的環(huán)境問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。

芹菜（Apium graveolens L.）作為大眾蔬菜，在我國(guó)種植較為廣泛。肖旭峰等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在重金屬污染較為嚴(yán)重的工礦、冶金、電鍍等企業(yè)或工業(yè)園區(qū)周邊，芹菜Cd污染超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[3]。本研究以水培芹菜為試驗(yàn)材料，初步探討不同Cd濃度脅迫下芹菜各部器官對(duì)Cd的富集、吸收及生理響應(yīng)，進(jìn)而為芹菜對(duì)Cd脅迫的適應(yīng)性研究及其抗Cd栽培實(shí)踐提供理論依據(jù)及借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

津南實(shí)芹1號(hào)芹菜種子，購(gòu)于河北青縣神華種子有限責(zé)任公司。對(duì)芹菜種子在溫室預(yù)先進(jìn)行育苗培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出6張真葉，轉(zhuǎn)移至人工氣候室進(jìn)行水培，晝、夜溫度分別為25、20 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%，光照時(shí)間為14 h。其間，先采用1/2濃度的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗1周，隨后采用塑料小桶并改用全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每桶3株，營(yíng)養(yǎng)液配方參考文獻(xiàn)[4]。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于2017年9—12月在嘉興學(xué)院環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，芹菜幼苗在全營(yíng)養(yǎng)液體系培養(yǎng)1周后，分別采用濃度為0（CK）、5、10、20、40 mg/L的硝酸鎘溶液進(jìn)行Cd脅迫處理，每處理重復(fù)3次。芹菜苗培養(yǎng)期間，每天用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)處理營(yíng)養(yǎng)液的pH值為5.5左右，營(yíng)養(yǎng)液4 d更換1次，并保持24 h通氣。Cd脅迫芹菜幼苗培養(yǎng) 14 d，將植株用自來(lái)水沖洗以去除根表吸附的Cd及其他離子，用25 mmol/L Na2-EDTA溶液浸泡根系15 min[5];用去離子水將幼苗沖洗干凈，用吸水紙吸干水分;部分根、葉樣品用于透射電鏡樣品制備，部分根、莖、葉置于-70 ℃冰箱貯藏，備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 鎘含量 稱(chēng)取根、莖、葉鮮樣各0.500 g分別置于 150 mL 三角瓶中，HNO3-HCl-HClO4法消煮完全;1% HCl定容，用美國(guó)戴安公司產(chǎn)ICS-2000型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）測(cè)定Cd含量，單位為mg/kg，其中，1 000 mg/L Cd標(biāo)準(zhǔn)液，購(gòu)于國(guó)家環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)為GBW（E）090066;計(jì)算芹菜對(duì)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、富集系數(shù)，公式分別為

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=幼苗地上部Cd含量/根Cd含量;

富集系數(shù)=地上部Cd含量/處理溶液Cd含量[6]。

1.3.2 生理特性 葉綠素含量參照乙醇-丙酮提取法[7]測(cè)定;葉片、根的可溶性蛋白含量參照考馬斯亮藍(lán)法[8]測(cè)定;根系活力參照氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法[9]測(cè)定，并計(jì)算TTC還原產(chǎn)物三苯基甲腙（TTF）的量，評(píng)價(jià)植物根系活力[10]。

1.3.3 透射電鏡（SEM）觀(guān)察 本觀(guān)察在浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心完成。取10 mg/L Cd脅迫處理14 d的芹菜根、葉樣品，參照徐劼的方法[11]對(duì)芹菜不同器官組織進(jìn)行前處理及制備：利用切片機(jī)將根、葉樣品切成80 nm的薄片，切片經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，采用HITACHI H7650型透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，采用SPSS 17.0軟件對(duì)各處理進(jìn)行最小顯著差異法（LSD）差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜對(duì)鎘的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)情況

由表1可知，隨Cd脅迫濃度的增加，芹菜葉、莖、根中的Cd含量呈逐漸上升趨勢(shì);同一濃度Cd脅迫下，芹菜各器官組織中的Cd含量由低到高依次為葉<莖<根，根對(duì)Cd的富集能力相對(duì)較強(qiáng);Cd脅迫濃度為40 mg/L，葉、莖、根中的Cd含量相對(duì)最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/kg，顯著高于其他處理（P<0.05）;Cd脅迫濃度為10 mg/L時(shí)，芹菜對(duì)Cd的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)相對(duì)最大，分別為5.83、0.62。

2.2 Cd脅迫下芹菜葉、根細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 由圖1可見(jiàn)，0 mg/L Cd脅迫處理（CK）的芹菜幼苗，其葉細(xì)胞中細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜相互緊貼，細(xì)胞核完整，核仁清晰可見(jiàn)，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，葉綠體為長(zhǎng)梭形，雙層被膜結(jié)構(gòu)清晰，且葉綠體中含有一定數(shù)量的嗜鋨顆粒及較小體積尺寸的淀粉顆粒，葉綠體基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)層次清晰、排列規(guī)整;10 mg/L Cd脅迫處理的芹菜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)模糊，輪廓不飽滿(mǎn)，葉綠體腫脹變形，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)松散，基粒類(lèi)囊體疏松呈波浪狀排列，葉綠體中淀粉顆粒體積尺寸變大。

2.2.2 根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 由圖2可見(jiàn)，0 mg/L Cd脅迫處理（CK）的芹菜幼苗根尖組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核質(zhì)界限分明，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，核仁完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈均勻分布;10 mg/L Cd脅迫處理的芹菜根組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生毒害，根細(xì)胞中液泡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞核仁消失，核內(nèi)染色質(zhì)外溢，胞內(nèi)線(xiàn)粒體脊突膨脹。

2.3 Cd脅迫對(duì)芹菜生理特性的影響

2.3.1 葉綠素含量 由表2可見(jiàn)，10 mg/L Cd脅迫處理時(shí)，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及其總量相對(duì)最高，分別為 1.867、0.656、2.523 mg/g，后隨Cd脅迫濃度的增加呈下降趨勢(shì);隨Cd脅迫濃度的增大，葉綠素a與葉綠素b比值呈先降低后上升趨勢(shì)，這與葉綠素a、葉綠素b含量的變化趨勢(shì)相反;不同濃度Cd脅迫處理下，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量相互間差異顯著（P<0.05）。

2.3.2 根、葉中可溶性蛋白含量 可溶性蛋白含量變化可間接反映Cd脅迫對(duì)芹菜組織中蛋白質(zhì)合成、降解或變性等過(guò)

程的影響。由圖3可見(jiàn)，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜葉中的可溶性蛋白含量逐漸減少， 而根中的可溶性蛋白含量正好相反，呈增加趨勢(shì);Cd脅迫濃度為5、10、20、40 mg/L時(shí)，芹菜葉、根組織中的可溶性蛋白含量分別為各自對(duì)照的98.73%、96.55%、91.28%、86.16%和99.74%、109.98%、132.76%、157.18%;Cd脅迫濃度為5 mg/L時(shí)，芹菜葉、根組織中的可溶性蛋白含量與對(duì)照處理差異不顯著（P>0.05），當(dāng)Cd脅迫濃度≥10 mg/L時(shí)，各處理相互間差異顯著（P<0.05）。

2.3.3 根系活力 植物對(duì)各種元素的吸收主要借助根系，根系的發(fā)育狀況對(duì)地上部生長(zhǎng)代謝活動(dòng)存在重要的影響。由圖4可知，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜根系活力呈逐漸降低趨勢(shì);Cd脅迫濃度為5、10、20、40 mg/L時(shí)，芹菜根系活力分別較CK下降15.33%、57.72%、58.69%、70.59%，說(shuō)明高濃度Cd脅迫對(duì)芹菜根的影響顯著（P<0.05），產(chǎn)生一定的毒害作用。

3 結(jié)論與討論

重金屬進(jìn)入植物體內(nèi)，通過(guò)在植物根部富集可一定程度上限制其向地上部遷移，進(jìn)而提高植物對(duì)重金屬的耐性。重金屬在植物根系組織中的大量累積是源于其透過(guò)根表進(jìn)入皮層組織細(xì)胞，與皮層細(xì)胞中的核酸、多糖、多肽、蛋白質(zhì)等化合物絡(luò)合而形成各種穩(wěn)定的、不溶大分子物質(zhì)[12]。本研究結(jié)果表明，同一鎘（Cd）濃度脅迫下，芹菜不同器官中的Cd含量由高到低分布為根>莖>葉，根中的Cd含量相對(duì)最高，與鄒金華等的研究結(jié)果[13-16]相似，而Cd在芹菜根系內(nèi)的過(guò)量累積可適當(dāng)減少其對(duì)地上部器官組織的傷害，這是芹菜一定條件下自我保護(hù)的一種耐受方式;隨Cd脅迫濃度的增加，芹菜葉、莖、根中的Cd含量提高，Cd脅迫濃度為40 mg/L，芹菜葉、莖、根中的Cd含量相對(duì)最高，分別為16.36、65.78、213.06 mg/kg，顯著高于其他處理（P<0.05），說(shuō)明高濃度的Cd脅迫可能對(duì)芹菜根系質(zhì)膜產(chǎn)生較大毒害作用，由于膜透性增強(qiáng)使得根系吸收的Cd更容易向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。

組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變會(huì)對(duì)植物的生理活動(dòng)產(chǎn)生一定負(fù)面影響[17]。Nash等研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，植物器官組織細(xì)胞中的線(xiàn)粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞膜及多核糖體等細(xì)胞器最先顯現(xiàn)受毒害癥狀[18]。植物光合作用功能的發(fā)揮主要由葉綠體結(jié)構(gòu)承擔(dān)完成，葉綠體結(jié)構(gòu)的正常與否對(duì)光合作用的影響至關(guān)重要[19]。正常環(huán)境下，葉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)中的類(lèi)囊體垛疊緊密，并能保持葉綠體膜電荷的穩(wěn)定，進(jìn)行更加有效的光能傳遞[20]，而此時(shí)胞內(nèi)超氧化物自由基的產(chǎn)生和消除也能維持在動(dòng)態(tài)平衡水平[21]。有研究認(rèn)為，葉綠體由正常的紡錘形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)成橢球或圓球形，一方面是由于重金屬的脅迫作用導(dǎo)致滲透壓的改變，另一方面重金屬脅迫也會(huì)造成葉細(xì)胞中過(guò)量H2O2的蓄積，最終通過(guò)Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生氧化能力超強(qiáng)的羥基自由基，從而造成膜脂過(guò)氧化過(guò)程的發(fā)生并破壞膜蛋白，引起膜結(jié)構(gòu)的改變[22]。線(xiàn)粒體是植物細(xì)胞代謝的能量中轉(zhuǎn)站，含有多種參與能量轉(zhuǎn)換的酶類(lèi)物質(zhì)。細(xì)胞的發(fā)育生長(zhǎng)及胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受控于細(xì)胞核[23]，進(jìn)入植物組織細(xì)胞的重金屬會(huì)與細(xì)胞核內(nèi)的大分子物質(zhì)如核酸發(fā)生結(jié)合作用，而造成染色體的畸變或斷裂[24]，最終導(dǎo)致細(xì)胞消亡。侯江濤等研究認(rèn)為，脅迫環(huán)境下，植物組織細(xì)胞中液泡增大可有利于吸收其他細(xì)胞器解體后所釋放出的有毒物質(zhì)，從而可適當(dāng)減輕這些有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及代謝途徑的破壞作用[25]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫造成芹菜葉細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)的改變，芹菜葉片細(xì)胞細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)模糊，輪廓不飽滿(mǎn)，淀粉顆粒增大變多，葉綠體被膜破損，類(lèi)囊體出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，Cd脅迫引起葉綠體光合功能喪失;芹菜不同器官組織細(xì)胞中的線(xiàn)粒體脊突出現(xiàn)膨脹或部分消失、溶解，線(xiàn)粒體正常的呼吸作用和糖代謝功能受到干擾;Cd脅迫導(dǎo)致根尖組織細(xì)胞中細(xì)胞基質(zhì)變稀，液泡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞器組織結(jié)構(gòu)遭受一定程度破壞，細(xì)胞核仁消失，染色質(zhì)外溢，線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹。

葉綠素含量高低可反映植物光合作用的水平，其中，葉綠素a發(fā)揮捕獲光能和原初反應(yīng)的作用，葉綠素b傳遞光能[26]。重金屬脅迫會(huì)導(dǎo)致葉細(xì)胞中葉綠素含量的下降，進(jìn)而使植物出現(xiàn)葉片失綠現(xiàn)象，而植物受重金屬毒害的作用程度，一定范圍內(nèi)可用葉綠素含量的變化間接評(píng)判[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，10 mg/L Cd脅迫處理時(shí)，芹菜葉片葉綠素a、葉綠素b及其總量相對(duì)最高，分別為1.867、0.656、2.523 mg/g，后隨Cd脅迫濃度的增加呈下降趨勢(shì)，而造成葉綠素含量下降的原因可能是Cd與葉綠體中膽色素原脫氨酶、原葉綠素脂還原酶、δ- 氨基乙酰丙酸合成酶等多種酶的巰基結(jié)合，使得葉綠體功能和結(jié)構(gòu)受到影響，從而使葉綠素分解[28]，可能是Cd脅迫引起葉細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致葉綠素的含量下降[29]，也有可能是Cd影響植物葉片組織對(duì)Fe、Mn元素的吸收，從而導(dǎo)致葉綠素含量和對(duì)CO2吸收量的減少，進(jìn)而影響葉綠素合成[28-30]。

植物組織內(nèi)的可溶性蛋白大多為參與各種代謝的酶類(lèi)組分，其含量高低反映體內(nèi)細(xì)胞總代謝水平能力的大小[31]，從某種意義可體現(xiàn)逆境生長(zhǎng)環(huán)境下植物生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱[32]，而重金屬脅迫造成植物組織中可溶性蛋白含量的變化主要是由于重金屬會(huì)影響蛋白酶的水解活性。同時(shí)，可溶性蛋白含量的增加，還意味著細(xì)胞滲透物質(zhì)濃度的提高及相關(guān)功能蛋白數(shù)量的增多，反過(guò)來(lái)會(huì)對(duì)細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨Cd脅迫濃度增大，芹菜根組織中的可溶性蛋白含量增加，這說(shuō)明在Cd脅迫下，芹菜根組織可通過(guò)某些生理生化轉(zhuǎn)化過(guò)程誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)金屬鰲合蛋白、金屬硫蛋白、脅迫蛋白等鎘結(jié)合蛋白，防止Cd敏感酶變性失活，從而弱化Cd的毒性作用，進(jìn)而提高植株對(duì)Cd脅迫的適應(yīng)能力[34];相對(duì)于根系而言，芹菜葉片對(duì)Cd的脅迫作用較為敏感，較低濃度的Cd脅迫也會(huì)造成葉片組織中活性氧自由基增多，造成葉細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，導(dǎo)致合成蛋白質(zhì)的酶活性受抑制，進(jìn)而影響某些可溶性蛋白的合成而導(dǎo)致蛋白含量降低，這可能是因?yàn)镃d脅迫作用能誘導(dǎo)植物組織中的蛋白快速分解[35]，而葉綠體中的蛋白質(zhì)含量占到葉片中蛋白質(zhì)總量的70%，Cd脅迫會(huì)造成葉綠體超微結(jié)構(gòu)的損傷，進(jìn)而使得蛋白含量水平隨Cd處理濃度的增大而不斷降低[33]。

植物根系活力可以表征根系代謝活動(dòng)過(guò)程中的吸收、合成、氧化及還原能力[36]。本研究結(jié)果表明，隨Cd脅迫濃度的增大，芹菜根系活力不斷下降，說(shuō)明Cd脅迫對(duì)芹菜根系產(chǎn)生一定的毒性作用，從而導(dǎo)致根系吸收水分、養(yǎng)分的能力減弱。

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