崔瀟婷 顧玲玲 吳萌 張繼玲 王安平

摘要：為對(duì)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的重組禽腺聯(lián)病毒進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定，將含GFP報(bào)告基因及AAAV兩側(cè)末端重復(fù)序列的重組桿狀病毒rBac-GFP、表達(dá)AAAV結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP、表達(dá)AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep以感染復(fù)數(shù)為5，同時(shí)感染搖瓶培養(yǎng)中的昆蟲細(xì)胞Sf9，72 h后收集細(xì)胞沉淀，反復(fù)凍融3～5次后，離心取上清。經(jīng)濾膜過濾、氯仿抽提和PEG沉淀后，進(jìn)行電鏡觀察和Western blot分析，并體外感染雞成纖維細(xì)胞和雞肝細(xì)胞系。SDS-PAGE結(jié)果顯示，rAAAV得到了較好的純化，電鏡下可觀察到大小約20 nm的典型細(xì)小病毒樣粒子，Western blot分析數(shù)據(jù)顯示rAAAV由3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，與野生病毒相似。體外表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示，rAAAV能介導(dǎo)GFP報(bào)告基因在雞細(xì)胞中穩(wěn)定持久地表達(dá)。表明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的rAAAV具有與野生病毒相似的性質(zhì)，可應(yīng)用于后繼研究和開發(fā)應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：重組禽腺聯(lián)病毒;桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);鑒定

中圖分類號(hào)：S852.65?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0153-03

收稿日期：2017-11-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31302096）;江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2013415）;江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目（編號(hào)：NY-009）。

作者簡(jiǎn)介：崔瀟婷，女，江蘇如皋人，講師，主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail：419445466@qq.com。

通信作者：王安平，博士，副教授，主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail：wap4017@163.com。

腺聯(lián)病毒（adeno-associated virus，AAV）又稱腺病毒相關(guān)病毒，作為一種新型的病毒載體，與其他重組病毒載體相比較，具有對(duì)宿主沒有致病性、免疫原性極低、宿主范圍廣、表達(dá)時(shí)間持久等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此被認(rèn)為是一種比較理想的基因轉(zhuǎn)移載體，目前廣泛地用于基因治療和基因工程疫苗等方面的研究。rAAV已有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的多個(gè)組織和細(xì)胞，并能介導(dǎo)外源基因在肺臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、視網(wǎng)膜及骨骼肌等器官和組織中的長(zhǎng)期表達(dá)[2-6]。

禽腺聯(lián)病毒（avian adeno-associated virus，AAAV）于1973年由Yates等首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[7]，AAAV的理化性質(zhì)、基因組結(jié)構(gòu)等與AAV基本相似，提示可作為有潛力的重組病毒載體開發(fā)應(yīng)用[8-9]。目前，重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法主要是三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，即將順式（攜帶ITR 和外源基因）、反式（編碼rep和cap）和輔助基因的3 種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，這種方法成本偏高、程序較繁、不宜擴(kuò)大生產(chǎn)，且獲得的重組禽腺聯(lián)病毒滴度偏低。2002年，Masahi 等發(fā)現(xiàn)Rep78在昆蟲細(xì)胞Sf9中無需輔助病毒或質(zhì)粒就能支持AAV DNA復(fù)制[10]，將重組桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)用于rAAV的生產(chǎn)，這種方法克服了傳統(tǒng)三質(zhì)粒法的技術(shù)難關(guān)，rAAV滴度大大提高，生產(chǎn)出的rAAV與使用293細(xì)胞生產(chǎn)得到的病毒載體在生物功能上沒有差異，桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞懸浮生產(chǎn)系統(tǒng)被證明是一種簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)的可以大規(guī)模生產(chǎn)的方法。

本實(shí)驗(yàn)室首次利用重組桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAAV的生產(chǎn)，本研究對(duì)昆蟲細(xì)胞制備的rAAAV進(jìn)行以系列的鑒定，為rAAAV的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體和細(xì)胞

含GFP報(bào)告基因及AAAV兩側(cè)末端重復(fù)序列的重組桿狀病毒rBac-GFP，表達(dá)AAAV結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP，表達(dá)AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;Sf9細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司;雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）用9～11日齡SPF雞胚制備;雞胚肝細(xì)胞系（CEL）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物制品工程技術(shù)中心提供。

1.2 工具酶和試劑

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM（Serum free medium），購(gòu)自GBICO公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3 rAAAV-GFP的制備

參照文獻(xiàn)[11]的方法，將Sf9昆蟲細(xì)胞以5×105 cells/mL 的初始密度接種于搖瓶中的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，110 r/min 27 ℃振搖培養(yǎng)，至密度達(dá)2×106 cells/mL時(shí)，以MOI為5，接種3種重組桿狀病毒rBac-GFP、rBac-VP、rBac-Rep。3 d后，離心收集細(xì)胞沉淀，于-80 ℃、37 ℃反復(fù)凍融3～5次，12 000 r/min離心10 min，收集上清，即為含GFP報(bào)告基因的重組禽腺聯(lián)病毒rAAAV-GFP。

1.4 rAAAV-GFP的純化

將以上制備的病毒液先用0.22 μm的濾膜過濾，除去雜質(zhì)和大分子蛋白，再加入1/10體積的氯仿在搖床上室溫劇烈振搖1 h，加入5 mol/L NaCl至終濃度為1 mol/L，12 000 r/min 離心10 min，取上層水相，加入PEG 8000至終濃度為10%，冰浴 1 h，12 000 r/min離心15 min，PBS溶解沉淀，即為純化的rAAAV-GFP。

1.5 rAAAV-GFP的電鏡鑒定

將純化的重組病毒rAAAV-GFP滴加于銅網(wǎng)上，經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，在投射電鏡下觀察。

1.6 rAAAV-GFP的Western blot分析

取少量的rAAAV-GFP純化產(chǎn)物，與等體積的2×loading buffer混勻后，煮沸3 min，取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，以未接種病毒的細(xì)胞沉淀作為陰性對(duì)照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印PVDF膜，以鼠抗VP3多抗作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot分析。

[6]Xiao X A，Li J A，Samulski R J. Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector[J]. Journal of Virology，1996，70（11）：8098-8108.

[7]Yates V J，El-Mishad A M，McCormick K J，et al. Isolation and characterization of an avian adenovirus-associated virus[J]. Infec Immun，1973（7）：973-980.

[8]Bossis I，Chiorin J A. Cloning of an avian adeno-associated virus（AAAV）and generation of recombinant AAAV particles[J]. Journal of Virology，2003，77（12）：6799-6810.

[9]Estevez C，Villegas P. Sequence analysis，viral rescue from infectious clones and generation of recombinant virions of the avian adeno-associated virus[J]. Virus Research，2004，105（2）：195-208.

[10]Urabe M，Ding C T，Kotin R M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors[J]. Human Gene Therapy，2002，13：1935-1943.

[11]Wang A P，Wang Y J，Wu S，et al. Efficient production of an avian adeno-associated virus vector using insect cell/baculovirus expression system[J]. Journal of Virological Methods，2017，240：26-31.

[12]Farson D，Harding T C，Tao L，et al. Development and characterization of a cell line for large-scale，serum-free production of recombinant adeno-associated viral vectors[J]. Journal of Gene Medicine，2004（6）：1369-1381.

[13]Durocher Y，Pham P L，St-Laurent G，et al. Scalable serum-free production of recombinant adeno-associated virus type 2 by transfection of 293 suspension cells[J]. Journal of Virological Methods，2007，144（1/2）：32-40.

[14]Lock M，Alvira M，Vandenberghe L H，et al. Rapid，simple，and versatile manufacturing of recombinant Adeno-Associated viral vectors at scale[J]. Human Gene Therapy，2010，21（10）：1259-1271. 李 超，高 麗，王育青，等. 用灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)法對(duì)9個(gè)苜蓿品種在田間旱作條件下葉綠素?zé)晒狻⑺旨吧a(chǎn)特性的綜合評(píng)價(jià)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（5）：156-161.