魏朝治 裘紀瑩 陳蕾蕾 陳相艷 劉孝永 辛雪

摘要：研究具有生物轉化銀杏花粉黃酮苷活性的惡味乳桿菌B2的益生特性和安全性。結果表明，該菌具有較好的β-葡萄糖苷酶活性和體外脫除膽固醇能力，對酸和人工模擬胃液的耐受性較好，而對膽鹽和人工模擬腸液的耐受性一般;同時該菌對10種常見抗生素不具有耐藥性，并且不攜帶耐藥基因，不具備硝酸鹽還原酶、氨基脫羧酶活性，不產生吲哚等有害代謝產物，因此該菌安全性較高。

關鍵詞：惡味乳桿菌B2;β-葡萄糖苷酶;益生特性;安全性;耐藥性

中圖分類號： TS201.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0162-04

收稿日期：2017-12-11

基金項目：山東省農業(yè)科學院創(chuàng)新工程（編號：CXGC2017B06）;山東省泰山學者工程項目;山東省農業(yè)科學院青年英才培養(yǎng)計劃;山東省自然科學基金三院聯(lián)合基金（編號：ZR2014YL020、ZR2016YL022）。

作者簡介：魏朝治（1992—），男，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：wczwcz0220@163.com。

通信作者：辛 雪，助理研究員，主要從事農產品加工研究。E-mail：jasmine811201@126.com。

乳酸菌（lactic acid bacteria，簡稱LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌通稱。這類細菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，是公認的安全性菌株（generally recognized as safe，簡稱GRAS）。乳酸菌不僅可應用于食品發(fā)酵行業(yè)，同時也能調節(jié)機體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡等，與機體的生命活動息息相關[1]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸菌具有抗生素抗性，甚至有些菌株出現(xiàn)了多重耐藥性[2]。

惡味乳桿菌B2是從手工泡菜中篩選到的1株能夠生物轉化銀杏花粉黃酮苷的優(yōu)良菌株，其培養(yǎng)條件簡單，易存活，產酸能力適中，口感較好，可用于活菌型功能性銀杏花粉產品的研制。但目前文獻報道缺乏關于惡味乳桿菌益生特性和安全性方面的研究。因此，本試驗以自主分離的1株惡味乳桿菌B2為研究對象，以β-葡萄糖苷酶活性、降解膽固醇能力以及耐酸、耐膽鹽、耐模擬腸胃液能力和耐藥性、有害代謝產物分析等為手段，開展其益生特性和安全性評價，旨在為進一步開發(fā)惡味乳桿菌資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 試驗用菌株為惡味乳桿菌B2，是由筆者所在實驗室自手工泡菜中分離得到的1株能夠轉化銀杏花粉黃酮苷的優(yōu)良菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 乳酸細菌（MRS）培養(yǎng)基[3]用于菌株活化、培養(yǎng)，MRS-膽固醇（MRS-CHOL）培養(yǎng)基[4]用于體外降解膽固醇試驗，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，對硝基苯酚（p-NP）、對硝基苯基β-D-葡萄糖苷（p-NPG）、磷酸氫二鈉、檸檬酸等均為分析純。

1.1.3 儀器與設備 CR22GⅢ高速冷凍離心機，日本日立公司生產;SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司生產;Mettler AE240電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產;UV-160型紫外可見分光光度計，日本島津公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng) 將菌株劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落活化傳代2次，經革蘭氏染色觀察為純菌后，接種于5 mL MRS液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性的測定[5] 粗酶液的制備：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用pH值為6.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液洗滌2遍，離心去上清，沉淀溶于相同緩沖液中，在0 ℃條件下超聲間歇粉碎15 min后，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，上清液為粗酶液。對硝基苯酚標準曲線的繪制：精準稱取0.139 mg對硝基苯酚純品，溶解于1 mL甲醇溶液中，用pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容到 100 mL，再稀釋為5.0、12.5、25.5、37.5、50.0、75.0 μmol/L等濃度梯度溶液;取100 μL稀釋后的pNP溶液，加入100 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液，測定其在405 nm處的吸光度，繪制對硝基苯酚標準曲線。β-葡萄糖苷酶活性的測定：將20 μL 25 mmol/L的p-NPG加入到80 μL的粗酶液中，在室溫下進行反應，30 min 后加入100 μL濃度為 1 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應，測定其在405 nm處的吸光度。根據對硝基苯酚標準曲線回歸方程計算生成的對硝基苯酚濃度。一個β-葡萄糖苷酶活性單位（U）定義為在一定的反應條件下，每分鐘分解對硝基苯基β-D-葡萄糖苷底物生成1 μmol對硝基苯酚（p-NP）所需要的β-葡萄糖苷酶量。計算公式如下：

U=pNP濃度×反應總體積反應時間×酶液體積×稀釋倍數(shù)。

1.2.3 體外降解膽固醇能力試驗 惡味乳桿菌B2體外降解膽固醇能力的測定參照文獻[4]進行。膽固醇工作液的配制：量取一定量的膽固醇配制膽固醇貯存液，并進一步稀釋，使膽固醇工作液的終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350 μg/mL。標準曲線的制作：取膽固醇工作液和鐵銨顯色劑各2.5 mL振蕩搖勻后，冷卻至室溫，以冰乙酸加顯色劑為空白對照，于560 nm處測定吸光度，以D560 nm為縱坐標，膽固醇含量為橫坐標繪制標準曲線。膽固醇含量的測定采用硫酸鐵銨法。在MRS-膽固醇（MRS-CHOL）液體培養(yǎng)基中接入1%（體積比）的乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），獲取上清液;用5 mL去離子水洗滌菌體沉淀（2次），離心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），獲得沉淀洗滌液;分別取上清液和沉淀洗滌液0.3 mL于離心管中，加入3.7 mL冰乙酸充分混勻，13 000 r/min離心 5 min;取上清液2.5 mL于試管中，沿管壁緩緩加入2.5 mL鐵銨顯色液，室溫靜置 20 min，然后充分振蕩搖勻，測定D560 nm。以未接種乳酸菌的MRS-CHOL培養(yǎng)基代替發(fā)酵液為空白。膽固醇的降解率按以下公式計算：

膽固醇的降解率=D空白-D樣品D空白×100%。

1.2.4 耐酸、耐膽鹽和耐模擬胃腸液試驗 參照高盛等的方法[6-7]測定惡味乳桿菌B2的耐酸、耐膽鹽、耐模擬胃腸液能力。耐酸試驗：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用0.85%生理鹽水洗滌2遍，離心去上清，沉淀重懸于等體積生理鹽水中，制成菌懸液。分別將上述菌懸液接種于pH值為1.5、2.5、3.5、4.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。耐膽鹽試驗：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用0.85%生理鹽水洗滌2遍，離心去上清，沉淀重懸于等體積生理鹽水中，制成菌懸液。分別將上述菌懸液接種于含不同濃度牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基（牛膽鹽質量分數(shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%）中，37 ℃條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。耐模擬胃腸液試驗：將胃蛋白酶過濾除菌，加入到滅菌的0.5% NaCl溶液中，胃蛋白酶終濃度為3 g/L，分別調節(jié)溶液pH值至1.5、2.5、3.5，即為供試的人工胃液;將胰蛋白酶和牛膽鹽過濾除菌，加入到滅菌的0.5% NaCl溶液中，胰蛋白酶和牛膽鹽終濃度均為 1 g/L，調節(jié)溶液pH值至8.0，即為人工腸液;將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，棄上清，沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，加入等體積的人工胃液或人工腸液，37 ℃ 條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。

1.2.5 耐藥性評價 藥敏試驗：采用藥敏紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗[8]。將100 μL待測菌液均勻涂布于MRS固體平板上，待菌液被完全吸收后放置藥敏紙片。供試藥敏紙片：購自杭州微生物試劑有限公司，紙片上附有抗生素分別為青霉素、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、阿莫西林、諾氟沙星、卡那霉素。質粒提取試驗：取5 mL待測菌液，使用OMEGA公司質粒提取試劑盒提取質粒;取提取好的質粒液體5 μL加入1 μL 6×Loading buffer，點樣于瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳液為1×TAE溶液，電壓為100 V，運行 30 min，電泳結束后，置于254 nm紫外燈下觀察。

1.2.6 有害代謝產物試驗 吲哚試驗：將菌液以2%（體積比）接種量接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，滴加吲哚試劑，觀測顏色變化情況，以不接菌液的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照，試驗作3次平行。硝酸鹽還原酶試驗：將菌液以2%（體積比）接種量接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液，觀察顏色變化情況，以不接菌液的硝酸鹽培養(yǎng)基為空白對照，試驗作3次平行。氨基脫羧酶活性檢測：將菌株劃線于添加前體氨基酸（L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸）的脫羧酶篩選平板上，以未添加前體氨基酸的脫羧酶篩選平板為對照，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，試驗作3次平行。

2 結果與分析

2.1 惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性

β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，釋放 β-D-葡萄糖和相應的配基。研究顯示，β-葡萄糖苷酶在生物轉化黃酮苷中有重要應用，同時，很多生物轉化黃酮苷優(yōu)良菌株具有分泌β-葡萄糖苷酶能力[9-11]。惡味乳桿菌B2能夠高效轉化銀杏花粉黃酮苷，因此檢測其β-葡萄糖苷酶活性，可為轉化機制研究提供參考。

2.1.1 對硝基苯酚標準曲線 以p-NP濃度為橫坐標，D405 nm為縱坐標，取3次測量的平均值繪制標準曲線，結果見圖1，標準曲線回歸方程為y=0.010 9x+0.002 4，r2=0.999。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶活性 惡味乳桿菌B2粗酶液經3次平行試驗后，測得的D405 nm值為0.283±0.002 7。將數(shù)據代入p-NP標準曲線回歸方程計算得到，生成的對硝基苯酚濃度為（25.74±0.01） μmol/L。通過計算得到惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性為16.09 U。

2.2 惡味乳桿菌B2的耐酸、耐膽鹽和耐模擬胃腸液能力

2.2.1 耐酸能力 人體胃液中胃酸的pH值一般在1.5～3.5 之間[7]。從圖2可以看出，惡味乳桿菌B2在pH值為35時表現(xiàn)出良好的酸耐受性，6 h內活菌數(shù)無明顯變化;在pH值為2.5時，每隔2 h，活菌數(shù)下降2個數(shù)量級，6 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級;當pH值為1.5時，2 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級，4 h后已無活菌檢出。說明該菌對酸的耐受性較好，在酸性環(huán)境下仍可存活較長時間并保持生長。

2.2.2 耐膽鹽能力 小腸中膽鹽濃度一般為0.1%～0.3%腸內容物[12]。從圖3可以看出，惡味乳桿菌B2在膽鹽濃度為0.1%時表現(xiàn)出較好的耐受性，6 h內活菌數(shù)與不加膽鹽相比無明顯差異;在膽鹽濃度為0.2%時，2 h后活菌數(shù)下降了3個數(shù)量級，6 h后無活菌檢出;在膽鹽濃度為0.3%時，2 h后無活菌數(shù)檢出。說明惡味乳桿菌B2的膽鹽耐受性一般，當膽鹽濃度達到0.3%時，該菌無法存活。

2.2.3 耐模擬胃腸液能力 胃液中含有胃蛋白酶和胃酸，所以胃液是一個富含蛋白酶并且低pH值的環(huán)境。人體攝入食物后，胃液的pH值會隨著胃酸的分泌和消耗在1.5～3.5之間波動。腸液里不僅富含胰蛋白酶和膽鹽，而且還是一個微堿環(huán)境。胃腸液中存在的酶、膽鹽以及酸堿環(huán)境對乳酸菌生長都有抑制作用。從圖4可以看出，在pH值為3.5的人工模擬胃液中，活菌數(shù)在6 h內沒有明顯變化，都保持在同一數(shù)量級。在pH值為2.5的人工模擬胃液中，6 h后活菌數(shù)下降了5個數(shù)量級。在pH值為1.5的人工模擬胃液中，4 h后已無活菌檢出。而在pH值為8.0的人工模擬腸液中，活菌數(shù)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，6 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級?？梢?，惡味乳桿菌B2對人工模擬胃液具有較好的耐受性，但對人工模擬腸液的耐受性一般。

2.3 惡味乳桿菌B2的降膽固醇能力

2.3.1 膽固醇標準曲線 以膽固醇濃度為橫坐標，對應吸光度（D560 nm）為縱坐標，取3次測量的平均值繪制標準曲線，結果見圖5，標準曲線回歸方程為y=0.000 9x-0.002 8，r2=0994。

2.3.2 體外降膽固醇能力 根據膽固醇標準曲線，計算惡味乳桿菌B2在MRS-CHOL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后上清液以及沉淀洗滌液中的膽固醇含量。從表1可以看出，惡味乳桿菌B2培養(yǎng)24 h后對膽固醇的脫除率達到40.24%，具有較好的體外降膽固醇能力。但沉淀洗滌液中膽固醇含量較低，表明大量的膽固醇可能被乳酸菌轉運至菌株體內，說明該菌株對膽固醇的清除能力主要依靠的是菌體吸收作用[13-14]。

2.4 惡味乳桿菌B2的耐藥性

惡味乳桿菌B2的耐藥性評價結果見表2。10種抗生素對惡味乳桿菌B2的的抑菌圈直徑均≥15 mm，抑菌效果比較明顯，因此認為惡味乳桿菌B2不具有耐藥性。此外，質粒提取試驗結果顯示，惡味乳桿菌B2不含有質粒，因此該菌株不攜帶耐藥基因。

2.5 惡味乳桿菌B2的有害代謝產物

色氨酸是人體必需氨基酸，如果菌株分解色氨酸生成吲哚，會引起人體代謝的紊亂。硝酸鹽還原酶可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，人體攝入過多亞硝酸鹽易引起中毒，同時在胃酸的條件下，亞硝酸鹽易與胺類物質反應生成強致癌物亞硝胺。氨基脫羧酶可以將氨基酸轉化為生物胺，若菌株含有氨基脫羧酶，則可以將L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸分別轉化為腐胺、精胺、亞精胺、尸胺。過量的生物胺會使人出現(xiàn)惡心、腹痛等食物中毒癥狀[8，15]。由表3可知，惡味乳桿菌B2不產生吲哚，無硝酸鹽還原酶活性，因此不能還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽。同時，惡味乳桿菌B2無氨基脫羧酶活性，不能以

3 討論與結論

研究結果顯示，惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性較高，因此可降解銀杏花粉黃酮苷中的β-葡萄糖苷鍵，釋放出主要黃酮苷元山奈酚。β-葡萄糖苷酶的活性測定為惡味乳桿菌B2生物轉化銀杏花粉黃酮苷的機制研究提供依據。益生特性研究結果表明，惡味乳桿菌B2具有良好的體外脫除膽固醇能力，對酸和人工模擬胃液的耐受性較好，而對膽鹽和人工模擬腸液的耐受性一般，說明惡味乳桿菌B2可能具有良好的通過胃的能力，但在小腸中的存活性一般?？傮w來說，惡味乳酸菌B2擁有一定的消化道通過能力，可在消化道存活并行使生理功能。安全性研究結果顯示，該菌對10種常見抗生素不具有耐藥性，并且不攜帶耐藥基因，同時不具備硝酸鹽還原酶活性和氨基脫羧酶，不生成亞硝酸鹽、亞硝胺、腐胺、精胺和亞精胺、尸胺等有害成分，不分解色氨酸生成吲哚，安全性較高。

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