游 剛，牛改改*

（廣西高校北部灣特色海產品資源開發(fā)與高值化利用高校重點實驗室，北部灣大學食品工程學院，廣西 欽州 535011）

方格星蟲（Sipunculus nudus）又稱光裸星蟲、沙蟲，廣布我國南北沿海，其中廣西北部灣海域資源較為豐富[1]。關于方格星蟲的研究主要集中在繁殖育種[2]、形態(tài)特征[3]、基因調控[4]、免疫活性[5]等方面。近年來，方格星蟲生物活性成分和酶解肽的制備及其抗氧化性研究已有相關文獻報道[6-10]。但是，由于酶解過程中引起的脂質氧化、蛋白質降解，加重了酶解物的腥苦味，影響整體風味和滋味。Maillard反應是在一定條件下由氨基官能團和羰基官能團通過縮合、環(huán)化和聚合等形成羰氨化合物的非酶褐變反應[11]。相關研究報道了Maillard反應可改善酶解物的感官特性和揮發(fā)性風味[12-13]；此外，不同種類糖對Maillard反應機制影響不同[14-15]，闡明不同種類糖對Maillard反應影響機制是控制形成目標產物的有效手段之一[14]。不同加工方式（水煮或油煎）對方格星蟲肉揮發(fā)性風味物質成分變化的影響已有報道[16]，然而，關于方格星蟲酶解物（Sipunculus nudus enzymatic hydrolysates，SEH）與不同種類糖的Maillard反應特性及其產物揮發(fā)性特征風味變化的研究較缺乏。所以，本實驗研究不同種類糖（葡萄糖、麥芽糖、木糖和阿拉伯膠）與SEH在一定條件下形成Maillard反應產物的褐變度、pH值、色差、總/游離氨基酸、熒光強度和特征風味變化，旨在為改善酶解物的風味和品質選擇更好的糖基供體提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮方格星蟲（體長（10±2）cm，體寬（1±0.5）cm，體質量（9±2）g） 廣西南寧安吉海鮮市場。

堿性蛋白酶、風味蛋白酶 索萊寶生化試劑有限公司；1,2-二氯苯（純度＞99%） 南京化學試劑有限公司；HCl、NaOH（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司；PEN3型便攜電子鼻 德國Asrinese公司；CM-3600d分光測色計日本柯尼卡·美能達公司；UV6100紫外-可見分光光度計上海美譜達公司；STAR A111 pH計 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照趙謀明等[17]報道的方法制備酶解物和Maillard反應產物。將方格星蟲去內臟、清洗、瀝干，攪碎。稱取一定量的碎肉與去離子水按1∶5（g/mL）混合，于85 ℃水浴中加熱30 min，冰浴、冷卻至室溫。調節(jié)pH 9.0，按底物質量的3%加入堿性蛋白酶（20萬 U/g），于50 ℃水浴中酶解120 min。然后，調節(jié)pH 6.5，加入等量的風味蛋白酶（30 000 U/g），相同溫度下繼續(xù)酶解120 min后，95 ℃滅酶10 min，隨后冰浴、冷卻至室溫。酶解液于8 000 r/min離心15 min，收集上清液（酶解物SEH）、凍干備用。

分別稱取一定量的凍干粉和不同種類的糖（凍干粉-糖質量比0.75∶1）溶于去離子水中，調節(jié)pH值至6.8，制備SEH和不同糖的混合體系（7 g/100 mL），于120 ℃反應120 min后，立即冰浴、冷卻，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩２煌N類的糖與酶解肽混合形成的Maillard反應體系為：酶解物-葡萄糖（SEH-glucose，SEHG）、酶解物-麥芽糖（SEH-maltose，SEHM）、酶解物-木糖（SEH-xylose，SEHX）和酶解物-阿拉伯膠（SEH-acacia，SEHA）。

1.3.2 吸光度測定

參考文獻[15]，采用紫外-可見分光光度計分別于波長294 nm和420 nm處測定吸光度。

1.3.3 色差測定

參考文獻[13]，采用分光測色計測定樣品的顏色參數(shù)變化：L*（亮度）、a*（＋紅色，－綠色）、b*（＋黃色，－藍色）、C*（色度）和ΔE（總色差）。其中C*=（a*2＋b*2）1/2，ΔE=（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1/2。采用去離子水作為參比。

其四，從審計未來角度看，CPA審計尋租影響審計行業(yè)的健康發(fā)展。會計師事務所的低價攬客等尋租活動和較低的審計質量，會導致社會公眾對CPA行業(yè)失去信任，這會影響CPA行業(yè)未來的良性發(fā)展。

1.3.4 總氨基酸和游離氨基酸測定

總氨基酸測定參考文獻[13,18]，并稍作修改。分別取1 mL樣品盛入水解管中，加入8 mL HCl溶液（6 mol/L）于110 ℃水解22 h，冰浴、冷卻至室溫。將消解液過濾、定容至50 mL，取1 mL水解液于100 mL燒杯中，置于60 ℃水浴中趕酸完全，用超純水定容至10 mL，取2 mL過0.22 μm膜后采用自動氨基酸分析儀測定。

游離氨基酸測定參考文獻[13,18]，并稍作修改。分別取10 mL樣品加入10 mL 10%的三氯乙酸溶液沉淀120 min，8 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液過0.22 μm膜后采用自動氨基酸分析儀測定。

1.3.5 內源性熒光發(fā)射光譜掃描

參考文獻[19]，采用熒光分光光度計掃描樣品內源性熒光強度變化。掃描參數(shù)設定為：激發(fā)波長298 nm，發(fā)射光譜掃描范圍309～450 nm，狹縫寬度5 nm，掃描溫度25 ℃。

1.3.6 電子鼻測定

參考文獻[20]，取25 mL樣品置于50 mL離心管中，保鮮膜密封，置于50 ℃水浴中加熱10 min，進行測定。設定參數(shù)為：傳感器室流量300 mL/min，測量樣品流量300 mL/min，清洗120 s，測量90 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對3 次重復實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05，差異顯著；采用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 吸光度和pH值變化

反應產物的顏色變化是一種直接、簡單判斷Maillard反應程度的方法[21]。在294 nm波長處的吸光度可用于檢測Maillard反應速率[22]，在420 nm波長處的吸光度可反映Maillard反應體系的褐變度[15]。圖1顯示了不同種類糖與SEH結合形成Maillard反應產物的吸光度（A420nm、A294nm）和pH值變化?；旌象w系反應產物的吸光度均高于SEH，表明不同糖與SEH之間發(fā)生Maillard反應；且SEHX反應產物的A420nm和A294nm均顯著高于其他組（P＜0.05），表明木糖參與Maillard反應的程度要高于其他糖（葡萄糖、麥芽糖和阿拉伯膠），與Laroque等[14]報道戊糖褐變速率較高的結論一致；同時，從反應體系pH值變化可知，SEH經加熱后pH值無顯著性變化，但Maillard反應產物的pH值均顯著減?。≒＜0.05），其中SEHX產物的pH值最小，歸因于Maillard反應過程中糖、氨基酸和肽等降解和相互作用形成了酸性化合物[21]。另外，不同糖對反應產物A420nm和A294nm的影響呈現(xiàn)相同趨勢，與Pirestani等[23]研究結果類似。Ajandouz等[22]研究發(fā)現(xiàn)A294nm增大表明反應體系形成一類無色的化合物，它們是形成褐色素和產生焦糖化反應的基礎物質。因此，A420nm和A294nm在Maillard反應進程中具有一定的關聯(lián)性。此外，Chevalier等[24]報道了短鏈多糖較長鏈多糖展現(xiàn)出較快的反應速率，它能夠解釋木糖參與的反應體系呈現(xiàn)較高的A420nm和A294nm的原因，但與本實驗得到的A420nm和A294nm（阿拉伯膠＞麥芽糖＞葡萄糖）的結果相反。這可能是因為：1）阿拉伯膠與SEH發(fā)生Maillard反應程度高于麥芽糖和葡萄糖，Pirestani等[23]證實了阿拉伯膠是一種較為適合的多糖易與蛋白質在一定條件下發(fā)生共聚接枝反應；2）發(fā)生Maillard反應時較高的反應溫度和較長的反應時間（120 ℃、120 min）可誘導焦糖化反應，Buera等[25]發(fā)現(xiàn)不同糖發(fā)生焦糖化反應的褐變強度大小為麥芽糖＞葡萄糖，與本實驗研究結果一致。根據(jù)圖1結果可以看出褐變度大小為木糖＞阿拉伯膠＞麥芽糖＞葡萄糖。

圖1 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的A420 nm、A294 nm和pH值的變化Fig. 1 Changes in A420 nm, A294 nm and pH of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.2 色差變化

食品顏色是由食品原料本身的顏色或者食品加工過程中產生有色物質形成的[26]。表1顯示了SEH與不同種類糖Maillard反應產物的顏色參數(shù)（L*、a*、b*、C*和ΔE*）變化。L*表示亮度，反映黑白組分；a*表示紅綠度，正值越大越偏向紅色，負值越大越偏向綠色[27]；b*表示黃藍度，正值越大越偏向黃色，負值越大越偏向藍色[27]；C*表示視覺顏色的飽和度、純度或強度，定義為從灰色（a*＝0和b*＝0）向純彩色的偏離程度；ΔE*表示總色差，值越大說明顏色變化越重。不同種類糖與SEH經Maillard反應后產物顏色均發(fā)生顯著變化：1）Maillard反應產物的L*均顯著減?。≒＜0.05），其中SEHX產物的L*最小，亮度最暗；2）Maillard反應產物的a*均增大，且SEHX產物的a*最大，表明反應產物的紅色加深；3）Maillard反應產物的b*均增大，且SEHX產物的b*最大，表明反應產物的黃色加深，褐變程度最大[27]，不同糖對應的b*大小順序（木糖＞阿拉伯膠＞麥芽糖＞葡萄糖）與2.1節(jié)部分結果一致；4）Maillard反應產物的C*均增大，且SEHX產物的C*最大，表明反應產物的顏色加深，色度增大[13]；5）Maillard反應產物的ΔE*均增大，且SEHX產物的ΔE*最大，表明反應產物的顏色加深。以上結果可以看出，木糖與SEH發(fā)生Maillard反應的程度最高，其次是阿拉伯膠，與反應產物的A294nm和A420nm變化結果一致。

表1 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的顏色參數(shù)變化Table 1 Changes in color parameters of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.3 游離氨基酸和總氨基酸含量變化

在Maillard反應過程中，糖分子結構中的羰基和游離氨基酸或肽發(fā)生共聚結合形成Schiff堿，因此游離氨基酸含量變化可反映SEH與不同糖之間的反應程度[28]。表2和表3分別顯示了SEH與不同糖Maillard反應前后游離氨基酸和總氨基酸含量變化。SEH的總氨基酸含量為904.073 mg/g，總游離氨基酸含量為202.963 mg/g，水解度（總游離氨基酸/總氨基酸）約為22.4%。由表2可知，SEH與不同糖發(fā)生Maillard反應后，反應產物的17 種游離氨基酸和總游離氨基酸含量較SEH均顯著降低（P＜0.05），表明氨基酸和肽結構中的α-氨基和ε-氨基與糖分子結構中的羰基結合形成共聚物，使得氨基酸含量減小[14]。經Maillard反應后，產物氨基酸含量變化差異主要與糖的反應活性有關。Chevalier等[24]證實了在一定條件下不同種類糖與蛋白質之間共聚作用力不同，例如，β-乳球蛋白和戊糖（核糖、阿拉伯糖）形成共價鍵，而與己糖（葡萄糖、乳糖）形成疏水作用和二硫鍵，與糖的反應活性有關。因此，Laroque等[14]認為反應后混合體系中可利用的氨基減少量越大對應糖的反應活性越強。然而，表2研究結果顯示總游離氨基酸含量大小順序為SEHM＞SEHX＞SEHG＞SEHA，該結果并不能說明對應糖的反應活性大小，因為糖和酶解肽在熱處理過程中（120 ℃），肽經歷兩種路徑轉化：一方面，大分子肽分解成小分子肽和氨基酸，另一方面，肽與糖或降解產物直接交聯(lián)形成高分子產物[21,29]。從褐變度結果可知，SEHX＞SEHA＞SEHM＞SEHG，結合表3顯示的總氨基酸含量大小順序為SEHM＞SEHG＞SEHA＞SEHX，由此推測SEH和木糖反應體系中肽大部分分解成小肽和氨基酸，補充Maillard反應消耗的氨基酸，促進了木糖和氨基酸的反應，進而減小了其總氨基酸含量；在SEH和阿拉伯膠反應體系中，肽轉變成氨基酸的程度小，可能與多糖的空間位阻作用有關[15]，因此，Maillard反應后消耗的氨基酸不能有效補充，導致總游離氨基酸含量最低，同時，分析總氨基酸含量變化結果，推測阿拉伯膠可能與肽直接作用，進而減小了總氨基酸含量；在SEH和麥芽糖反應體系中，總游離氨基酸含量最高的原因可能是麥芽糖更傾向與小肽相互作用，促進了大分子肽分解成小分子肽和氨基酸，從而增大了體系總游離氨基酸含量；而SEH和葡萄糖反應體系的總游離氨基酸含量最低歸因于其Maillard反應程度小，但其總游離氨基酸含量高于SEHA可能是因為大分子肽轉變成氨基酸的程度要高于SEH和阿拉伯膠體系[15]。這與Huang Xiaoqin等[15]報道結果有一定的差異歸因于反應原料（氨基酸、酶解肽）和條件（溫度、pH值、底物濃度等）的不同，不能進行有效的結果對比分析。

表2 SEH與不同糖Maillard反應前后游離氨基酸含量變化Table 2 Variations in free amino acid composition of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides mg/g

酶解物中的肽含有疏水性氨基酸，它們導致終產物呈現(xiàn)苦味而被稱之為苦味氨基酸[30]。在所測17 種氨基酸中（表2），有8 種苦味氨基酸Val、Leu、Ile、Met、Phe、Ser、Arg、His，其中Arg、His和Met呈現(xiàn)強苦味[21]。SEH與糖Maillard反應產物的總苦味氨基酸含量均顯著降低（P＜0.05），其中SEHA中的總苦味氨基酸含量最低，SEHM中的含量最高，改善了酶解液的苦味。Lan Xiaohong等[21]研究發(fā)現(xiàn)Maillard反應減少了大豆蛋白肽的苦味氨基酸含量，支持了本研究結果。此外，表3顯示Maillard反應產物的每種氨基酸含量低于SEH，可能是由于Strecker降解、熱分解、以及糖和氨基酸或肽結合形成Maillard產物導致[21]，這與Liu Ping等[18]研究結果一致。從不同糖對總氨基酸減少率大小順序分析即SEHM（19.967%）＜SEHG（22.050%）＜SEHA（23.399%）＜SEHX（35.172%），可推斷出不同糖與SEH的反應程度大小順序為木糖＞阿拉伯膠＞葡萄糖＞麥芽糖，與褐變度變化和色差分析結果一致。

表3 SEH與不同糖Maillard反應前后總氨基酸含量變化Table 3 Variations in total amino acid composition of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides mg/g

2.4 內源性熒光強度變化

內源性熒光強度變化可用于評價反應體系中糖與蛋白質或肽共聚形成Maillard反應產物而引起的結構變化[31]。圖2顯示了SEH和SEH與不同糖形成的反應產物的內源性熒光光譜圖。SEH與不同糖反應后，熒光強度顯著降低，其中最大熒光強度大小順序為SEH＞SEHM＞SEHG＞SEHA＞SEHX，且SEHX熒光吸收峰幾乎消失，歸因于不同糖與SEH共聚結合具有一定屏蔽效應[15]，木糖對SEH構象的影響最大，其次是阿拉伯膠、葡萄糖和麥芽糖，這與不同糖和SEH的反應程度大小順序（即：木糖＞阿拉伯膠＞葡萄糖＞麥芽糖）的結論一致。另外，與SEH比較，Maillard反應產物的最大吸收峰發(fā)生輕微紅移，表明SEH中的肽或蛋白質分子結構中酪氨酸（Tyr）暴露于親水性環(huán)境，三級結構發(fā)生改變[32]。Huang Xiaoqin等[15]研究不同糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖和淀粉）與卵清蛋白Maillard反應產物的熒光強度變化，發(fā)現(xiàn)蛋白質-糖共聚物的熒光強度顯著降低，支持了本實驗結果。

圖2 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的內源性熒光光譜圖Fig. 2 Intrinsic fl uorescence intensity of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

2.5 電子鼻分析

2.5.1 傳感器的G/G0響應值分析

表4 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的氣味響應值Table 4 Odor response values of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

電子鼻檢測傳感器探測到樣品揮發(fā)性物質成分后，由此產生的電導率G/初始電導率G0比值變化作為信號響應，若G/G0響應值偏離1（小于或者大于1），表示對揮發(fā)性成分氣味有響應，其風味貢獻大，若G/G0值接近或等于1，表示沒有對氣體無感應或氣體濃度低于檢測限[33]。SEH與不同種類糖Maillard反應產物的氣味響應值如表4所示，其對應的直觀雷達圖如圖3所示。4號和5號傳感器G/G0響應值接近1，表明氫氣和烷烴類揮發(fā)性成分對SEH和Maillard反應產物風味無貢獻。1號和3號傳感器G/G0響應值均小于1，說明SEH和Maillard反應產物均含有芳香苯類和氨類揮發(fā)性成分，添加葡萄糖、麥芽糖和阿拉伯膠對SEH反應產物對芳香苯類和氨類揮發(fā)性成分影響不大，然而，添加SEHX對應的G/G0值小于其他組，表明木糖對對SEH反應產物對芳香苯類和氨類揮發(fā)性成分影響較大。10號傳感器G/G0響應值均大于1，且相互之間差異不大，表明Maillard反應前后芳香烷烴類揮發(fā)性成分變化不明顯。另外，2、6、7號和9號傳感器G/G0響應值偏離1，且相互之間差異明顯，表明SEH與糖發(fā)生Maillard反應前后，氨氧化物、甲烷、硫化氫類成分變化較大，其中添加木糖組的SEHX風味成分變化最明顯。袁林等[12]采用同樣的方法分析了牡蠣酶解產物及其Maillard反應產物的揮發(fā)性風味變化。

圖3 Maillard反應產物的氣味響應值的雷達圖Fig. 3 Response value radar chart of odor in Maillard reaction products

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）結果

圖4 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的電子鼻PCA圖Fig. 4 PCA plot of Maillard reaction products formed by SEH conjugated with different saccharides

PCA是通過提取傳感器的多指標信息，通過數(shù)據(jù)轉換、降維和線性分類，得到兩維散點圖，經過PCA方法轉換后得到的PC1和PC2的貢獻率累計方差大于總方差的85%，表明主要成分可較好地反映樣品的信息[33-34]。圖4顯示了SEH及其對于的Maillard反應產物的電子鼻響應值PCA結果。PC1的貢獻率為99.47%，PC1和PC2的總貢獻率為99.92%，表明PCA能較好地反映原始高維矩陣數(shù)據(jù)信息。SEH和Maillard反應產物（SEHG、SEHM、SEHX和SEHA）風味響應值沒有重疊區(qū)域，表明電子鼻PCA方法可有效區(qū)分SEH反應前后產物的特征風味變化。整體上看，與SEH風味響應輪廓比較，SEHG和SEHM距離較近，而SEHA和SEHX距離較遠，表明添加木糖或阿拉伯膠對Maillard反應產物的特征風味影響較大，同時葡萄糖和麥芽糖對Maillard反應產物特征風味的影響效果較接近。不同種類的糖對反應產物的特征風味產生不同影響可能與其參與Maillard反應程度有關。

2.5.3 負荷加載分析結果

圖5展示了方格星SEH與不同種類糖Maillard反應產物的電子鼻負荷加載分析，可清晰地呈現(xiàn)每個傳感器對PCA的貢獻率。3、4、5號和10號傳感器位于坐標（0,0）附近，且位置相鄰，表明傳感器信號變化較弱，對應的風味（氨類、氫氣、烷烴和芳香烷烴類成分）貢獻率較小。1號和8號傳感器在PC1和PC2上貢獻率相當，響應值偏小，2號和7號傳感器在PC1上貢獻率較大，6號和9號在PC2上貢獻率較大，表明氨氧化物、甲烷、硫化氫類成分是區(qū)別SEH和SEH-糖反應產物的主要揮發(fā)性特征風味，這與2.5.1節(jié)不同傳感器響應值的研究結果吻合。

圖5 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的電子鼻負荷加載分析圖Fig. 5 Loadings analysis of Maillard reaction products formed by SEH conjugating with different saccharides

2.5.4 線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）結果

LDA傾向于將所測樣品在空間中的分布狀態(tài)及彼此之間的距離分析等信號數(shù)據(jù)通過運算法則投影到某一方向，使得不同樣品組間的投影盡可能分開[34]。圖6顯示了SEH與不同種類糖Maillard反應產物的電子鼻LDA圖。判別式LD1和LD2的貢獻率分別為94.32%和4.55%，兩判別式的總貢獻率98.87%，基本上可代表樣品的主要信息特征。采用LDA能夠較好區(qū)分SEH和SEH-糖反應產物的特征風味差異性。值得注意的是，采用LDA，可明顯區(qū)分SEHG和SEHM特征風味，好于PCA效果。對于SEHA和SEHX，LDA和PCA區(qū)分效果相似。因此，盡管LDA和PCA兩種方法都能應用于SEH和不同糖Maillard反應產物特征風味的區(qū)分，由于LDA判別法考慮了種類間差異及組內集中程度，并最大化處理，所以總體上LDA區(qū)分效果好于PCA，更適合用于SEH-糖Maillard反應產物特征風味的區(qū)分。這與李靖等[35]采用電子鼻快速檢測油炸油品質發(fā)現(xiàn)LDA較PCA更適合區(qū)分油品品質的結論一致。

圖6 SEH與不同種類糖Maillard反應產物的電子鼻LDA圖Fig. 6 LDA of Maillard reaction products formed by SEH conjugating with different saccharides

3 結 論

不同種類的糖與SEH反應后，Maillard反應產物的褐變度均增大、pH值均減小，L*均減小且a*、b*、C*和ΔE*均增大，產物的17 種游離氨基酸和總氨基酸含量較SEH均顯著降低，其中8 種苦味氨基酸含量顯著降低，改善了酶解液的苦味，從褐變度、色差變化、氨基酸含量變化、熒光掃描光譜結果分析，不同糖與SEH的反應程度大小順序為木糖＞阿拉伯膠＞葡萄糖＞麥芽糖，且SEH三級結構發(fā)生改變。電子鼻能夠較好地區(qū)分SEH與不同糖形成的Maillard反應產物特征風味，負荷加載分析表明氨氧化物、甲烷、硫化氫類成分是區(qū)別SEH和Maillard反應產物的主要揮發(fā)性特征風味。因此可根據(jù)工藝需求選擇合適的糖基供體與SEH發(fā)生Maillard反應制備目標產物。后續(xù)實驗將進一步采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用定性定量分析酶解物與不同種類糖的Maillard反應產物揮發(fā)性風味成分變化，分析并找出主要風味貢獻成分，在分子水平上解釋不同糖與酶解物Maillard反應形成揮發(fā)性風味成分機制，為改善酶解物的風味和品質選擇更好的糖基供體提供理論參考。