毛俊 朱項(xiàng)羽 夏宏光 王志豪 劉慧茹 江海燕 金涌

中圖分類(lèi)號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）21-2942-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.13

摘 要 目的：研究甘草酸對(duì)大鼠體內(nèi)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)的影響。方法：將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃甘草酸5 mg/kg，對(duì)照組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日1次，連續(xù)給藥14 d，第14天灌胃30 min后，2組大鼠均灌胃硝苯地平3 mg/kg，并于灌胃硝苯地平前與灌胃后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h眼內(nèi)眥靜脈叢采血0.5 mL。采用高效液相色譜法，以地西泮為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定其中硝苯地平的濃度;色譜柱為ODS-C18;流動(dòng)相為甲醇-水（62 ∶ 38，V/V，乙酸調(diào)pH為4.5）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm;進(jìn)樣量為20 μL。使用Winonlin 6.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠體內(nèi)硝苯地平的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax分別為（1.40±0.15）、（1.50±0.01） h;cmax分別為（0.15±0.03）、（0.29±0.09） mg/L;t1/2分別為（4.70±1.17）、（5.20±1.38） h;AUC0-24 h分別為（1.00±0.10）、（1.89±0.37） mg·h/L;AUC0-∞分別為（1.00±0.16）、（1.98±0.32） mg·h/L;MRT分別為（6.76±0.64）、（6.60±1.36） h。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)硝苯地平的cmax、AUC0-24 h、AUC0-∞均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：甘草酸可能會(huì)降低硝苯地平在大鼠體內(nèi)的生物利用度，兩藥聯(lián)用時(shí)建議增加硝苯地平的劑量以達(dá)到有效的血藥濃度。

關(guān)鍵詞 甘草酸;硝苯地平;地西泮;高效液相色譜法;藥動(dòng)學(xué);大鼠

Effects of Glycyrrhizic Acid on Pharmacokinetics of Nifedipine in Rats

MAO Jun1，2，ZHU Xiangyu1，XIA Hongguang1，WANG Zhihao1，LIU Huiru2，JIANG Haiyan1，JIN Yong1（1.Key Lab of Anti-inflammatory and Immune Medicine， Ministry of Education， School of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China;2.Dept. of Pharmacy， Hefei Second People’s Hospital， Hefei 230026， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of glycyrrhizic acid on the pharmacokinetics of nifedipine in rats. METHODS： Rats were randomly divided into experimental group and control group， with 10 rats in each group. Experimental group was given glycyrrhizic acid 5 mg/kg and control group was given 0.5% CMC-Na （sodium carboxymethylcellulose） solution， once a day， for 14 consecutive days. On 14th day after 30 min of intragastric administration， both groups were given nifedipine 3 mg/kg intragastrically. Blood samples 0.5 mL were collected from intraocular vein plexus before and at 0.25， 0.5， 0.75， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 12 and 24 h after intragastric administration. The concentration of nifedipine was determined by HPLC using diazepam as internal standard. The determination was performed on ODS-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （62 ∶ 38， ? ? V/V，pH adjusted to 4.5 with acetic acid） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was set at 238 nm， and sample size was 20 μL. The pharmacokinetic parameters were calculated with Winonlin 6.0 software， and statistical analysis was performed by t-test. RESULTS： The main pharmacokinetic parameters of the experimental group and the control group were as follows as tmax was （1.40±0.15）， （1.50±0.01） h; cmax was （0.15±0.03）， （0.29±0.09） ? ? ?mg/L; t1/2 was （4.70±1.17）， （5.20±1.38） h; AUC0-24 h were （1.00±0.10）， （1.89±0.37） mg·h/L; AUC0-∞ was （1.00±0.16）， （1.98±0.32） mg·h/L; MRT was （6.76±0.64）， （6.60±1.36） h， respectively. Compared with control group， cmax， AUC0-24 h and AUC0-∞ of nifedipine were decreased significantly in experimental group， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： Glycyrrhizic acid can reduce the bioavailability of nifedipine in rats. It is suggested that the dosage of nifedipine should be increased in order to achieve effective blood concentration.

KEYWORDS ? Glycyrrhizic acid; Nifedipine; Diazepam; HPLC; Pharmacokinetics; Rat

硝苯地平是當(dāng)今治療心腦血管疾病最常見(jiàn)的一線(xiàn)藥物，主要用于高血壓、心律失常、心絞痛等病的治療。該藥在發(fā)揮藥效的同時(shí)，常常會(huì)引起轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸等藥物性肝損傷[1]。甘草是一種歷史悠久、應(yīng)用廣泛的中藥，在方劑中常作為使藥，有“無(wú)甘草不成方”之說(shuō)，在中醫(yī)經(jīng)方《傷寒論》一百一十三方中，多達(dá)七十七方含有甘草[2]。甘草中的主要活性物質(zhì)甘草酸不僅在心血管疾病的防治方面具有非常重要的作用[3]，還是常規(guī)的保肝藥物，臨床上常用來(lái)治療硝苯地平等藥物引起的肝損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)初步探討了甘草酸對(duì)大鼠體內(nèi)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)的影響，以期為臨床合理應(yīng)用甘草酸制劑治療硝苯地平引起的肝損傷提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20高效液相色譜儀（包括LC-20A真空在線(xiàn)脫氣機(jī)、LC-20AT四元泵、CTO-10 AS柱溫箱、 SPD-M20 A檢測(cè)器）和AUY120電子天平均購(gòu)自日本Shimadzu公司;5427R離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）;VX-Ⅲ渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）;BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)科技有限公司）;HPX-9052MBE恒溫烘箱（上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 藥品與試劑

地西泮對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：439-14-5，純度：99.7%）;甘草酸對(duì)照品和硝苯地平對(duì)照品（阿拉丁公司，批號(hào)：1405-86-3、21829-25-4，純度：99.73%、99.76%）;甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：67-56-1，色譜級(jí)）;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號(hào)：C8621-25g）和肝素鈉（批號(hào)：9041-08-1）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;乙酸乙酯和環(huán)已烷均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF（無(wú)特定病原體）級(jí)，♀，2月齡，體質(zhì)量（210±20） g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（皖）2017-006。所有大鼠飼養(yǎng)在溫度、濕度、燈光受調(diào)控的房間，給予正常飲食，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃甘草酸5 mg/kg[5]（溶劑為0.5%CMC-Na溶液，給藥劑量按臨床成人常用劑量換算），對(duì)照組大鼠灌胃等量的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，連續(xù)14 d。第13天夜里，將大鼠禁食過(guò)夜（晚上10：00-第2天白天實(shí)驗(yàn)前），但是自由飲水，于第14天灌胃30 min后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠同時(shí)灌胃硝苯地平3 mg/kg[6]（溶劑為0.5%CMC-Na溶液，給藥劑量按臨床成人常用劑量換算）。

2.2 樣品采集

分別于給予硝苯地平前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h從眼內(nèi)眥取血0.5 mL，置于預(yù)先加入肝素鈉的試管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min， -20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取硝苯地平對(duì)照品3.0 mg，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的硝苯地平貯備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取甘草酸對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為1.0 ? mg/mL的甘草酸貯備液。上述溶液均置于冰箱2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)取地西泮對(duì)照品1.00 mg，置于100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密量取內(nèi)標(biāo)貯備液1.00 mL，置于100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于冰箱2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品的處理

精密量取待測(cè)血漿樣品200 μL，置于1.5 mL EP管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL），加入乙酸乙酯-環(huán)己烷混合液（3 ∶ 1，V/V）[7]1 mL萃取，渦旋1 min，4 000 ? ? r/min離心5 min。取上清液0.8 mL，置于干凈的EP管中，55 ℃水浴加熱，N2吹干，并將殘余物用100 μL流動(dòng)相復(fù)溶，取20 μL上清液進(jìn)樣分析。

2.5 色譜條件

色譜柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（62 ∶ 38，V/V，乙酸調(diào)pH為4.5）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm;進(jìn)樣量：20 μL。

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取空白血漿、加硝苯地平的空白血漿、大鼠灌胃后12 h時(shí)的給藥血漿各1份，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后（其中空白血漿不加內(nèi)標(biāo)溶液），再按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示，硝苯地平和地西泮的保留時(shí)間分別為9.6、5.9 min，血漿里的雜質(zhì)不影響硝苯地平的測(cè)定，硝苯地平和地西泮可以完全分離，峰形良好，可見(jiàn)本方法具有專(zhuān)屬性高、分離度好的特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確測(cè)定硝苯地平的濃度。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.7 線(xiàn)性關(guān)系與定量下限的考察

將200 μL空白血漿，置于離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng/mL），再分別加入50 μL不同質(zhì)量濃度的硝苯地平對(duì)照品溶液至終濃度分別為20、40、80、160、320 ng/mL。再按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后（不再加內(nèi)標(biāo)溶液），按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以硝苯地平質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以硝苯地平與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的均數(shù)為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得回歸方程為y=0.011x-0.006 6（r=0.999 4），硝苯地平的檢測(cè)質(zhì)量濃度在20～320 ng/mL線(xiàn)性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。以信噪比值=10確定的定量下限為5 ng/mL。

2.8 精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性試驗(yàn)

將200 μL空白血漿，分別加入不同質(zhì)量濃度的硝苯地平對(duì)照品溶液至終濃度分別為20、80、320 ng/mL。按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，每個(gè)濃度同日內(nèi)測(cè)定5次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d考察日間精密度;以測(cè)得值與真實(shí)值的比值計(jì)算準(zhǔn)確度。分別放置0、1、2、3、6、12、24 h后再按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，然后按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，20、80、320 ng/mL血漿樣品的日內(nèi)、日間精密度的RSD和穩(wěn)定性的RSD均小于10%（n=5或n=7），準(zhǔn)確度在80%～120%之間，RSD均小于10%（n=5），表明本方法精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性考察均符合相關(guān)要求。精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.9 藥動(dòng)學(xué)研究

取“2.2”項(xiàng)下各采血時(shí)間點(diǎn)的血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算硝苯地平濃度，繪制2組大鼠體內(nèi)硝苯地平的藥-時(shí)曲線(xiàn)。再采用Winonlin 6.0軟件通過(guò)非房室模型分析計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。 其中，tmax和cmax是實(shí)測(cè)值，AUC0-24 h由前24 h每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度通過(guò)梯形法計(jì)算得到，AUC0-∞=AUC0-24 h+c24 h/λ（c24 h是最后24 h的血藥濃度，λ是末端消除速度常數(shù)，即藥-時(shí)曲線(xiàn)末端直線(xiàn)部分的斜率），t1/2=0.693/λ，平均滯留時(shí)間（MRT）=AUMC/AUC（AUMC是指一階距藥-時(shí)曲線(xiàn)下面積）。采用SPSS 13.0軟件對(duì)兩組大鼠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。兩組大鼠體內(nèi)硝苯地平的藥-時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較見(jiàn)表2。

由表2結(jié)果可見(jiàn)，兩組大鼠體內(nèi)硝苯地平的tmax、t1/2、MRT差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)硝苯地平的cmax、AUC0-24 h、AUC0-∞均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

當(dāng)今社會(huì)，臨床上中西藥結(jié)合治療已成常態(tài)。中西藥聯(lián)用可以發(fā)揮各自?xún)?yōu)勢(shì)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高療效，但也會(huì)不可避免地因兩者發(fā)生相互作用從而引起一系列不良反應(yīng)，其中代謝酶的改變是最主要因素之一。硝苯地平為肝臟主要代謝酶細(xì)胞色素P450（CYP）3A4的底物[8]，而甘草酸會(huì)誘導(dǎo)CYP3A4的活性[9]，所以甘草酸有可能會(huì)對(duì)硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)產(chǎn)生影響。

有文獻(xiàn)[10]記載大鼠的性別對(duì)CYP3A4酶影響很大，考慮到雌鼠的CYP3A4代謝與人類(lèi)更接近，所以本實(shí)驗(yàn)均以雌性的SD大鼠作為藥動(dòng)學(xué)研究的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，硝苯地平聯(lián)用甘草酸后，硝苯地平的AUC0-24 h降低34.6%、AUC0-∞降低34.7%，并伴隨著cmax的輕度降低（22.8%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示硝苯地平在體內(nèi)的代謝過(guò)程發(fā)生改變，血藥濃度出現(xiàn)明顯下降，這可能與甘草酸是CYP3A4的誘導(dǎo)劑有關(guān)。Lee KJ等[11]使用平衡透析法進(jìn)行了蛋白質(zhì)結(jié)合研究，發(fā)現(xiàn)加入甘草酸后，主要影響了硝苯地平與人血清白蛋白（HSA）的結(jié)合，從而使硝苯地平與血清的結(jié)合發(fā)生位移，血清K值降低。然而甘草酸的使用并沒(méi)有使硝苯地平的tmax、t1/2、MRT發(fā)生明顯變化，這可能與甘草酸對(duì)機(jī)體CYP系統(tǒng)影響較為復(fù)雜有關(guān)。CYP2C是CYP家族重要的一員，約占大鼠CYP總量的55%，參與很多藥物代謝。張瑛瑛[12]指出甘草酸對(duì)大鼠CYP3A4、CYP2B1、CYP1A2等具有誘導(dǎo)作用，對(duì)人的CYP2C19活性卻沒(méi)有影響。但甘草次酸卻可以明顯抑制CYP2C9和CYP2C19的活性。所以筆者猜測(cè)，tmax、t1/2、MRT未發(fā)生明顯變化的原因可能是甘草酸對(duì)CYP2B1、CYP1A2等其他酶也產(chǎn)生了影響，也可能是甘草酸灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)生成了主要的活性成分甘草次酸，而甘草次酸進(jìn)一步影響了其他代謝酶的活性。

總之，甘草酸改變了硝苯地平的代謝，對(duì)硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)產(chǎn)生了影響。提示兩者配伍時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加硝苯地平的用量，使之維持有效的血藥濃度。筆者后期將進(jìn)一步考察更長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間、更大劑量甘草酸可能對(duì)硝苯地平帶來(lái)的影響，而且由于甘草酸對(duì)機(jī)體CYP代謝酶系統(tǒng)影響較為復(fù)雜，甘草酸影響硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)機(jī)制也有待于繼續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2019-05-30 修回日期：2019-09-17）

（編輯：鄒麗娟）