張序晴 彭蘭 李賽 李耀偉 喻陽 曾嶸 任衛(wèi)瓊 鄧凱文 王志琪

〔摘要〕 目的 研究附子-甘草合煎液和混合液對離體蛙心的影響及其物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 通過離體蛙心實驗觀察附子-甘草合煎液和混合液對離體正常蛙心和心衰蛙心功能的影響，應(yīng)用高效液相色譜法建立并測定附子-甘草煎液的HPLC指紋圖譜。結(jié)果 附子-甘草合煎液與混合液的強心作用有差別;附子與甘草配伍后其指標(biāo)成分的含量發(fā)生了明顯變化，且合煎液與混合液的成分變化差別顯著。結(jié)論 附子-甘草合煎液和混合液對離體蛙心的作用及其指紋圖譜均不一致。

〔關(guān)鍵詞〕 附子;甘草;離體蛙心;指紋圖譜;合煎液;混合液

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.008

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，味辛甘，性大熱，其功效竣猛，且有大毒[1]。有毒中藥常用的解毒方法有炮制和配伍等[2]。甘草，味甘而性平，具有調(diào)和諸藥之功效。附子-甘草配伍是經(jīng)典藥對，一般認(rèn)為甘草配伍附子可起到減毒增效的作用。

研究表明，附子生物堿與甘草有效部位配伍能明顯降低毒性，并協(xié)同增加附子的強心作用[3]。附子強心作用可通過離體蛙心實驗加以研究，而指紋圖譜是定量分析中藥的重要手段。故本實驗首先在離體器官水平觀察附子-甘草合煎液與單煎后混合液對離體蛙心的作用，另一方面建立附子-甘草配伍前后的HPLC指紋圖譜來探討其物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為附子-甘草藥對的藥效和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1? 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;FW177型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）;DK-98Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）;SB-5200 DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。

烏頭堿（批號：16041801）、新烏頭堿（批號：16102001）、苯甲酰新烏頭原堿（批號： 16060804）、異甘草苷（批號：151120）、甘草苷（批號：160421）次烏頭堿（批號：16102002）、異甘草素（批號：16061501）、甘草素（批號：151013）、甘草酸（批號：160418），以上對照品均購自深圳菲斯生物科技有限公司。生附子產(chǎn)自四川江油，甘草產(chǎn)自甘肅，上述藥材均經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室周小江教授鑒定。乙腈、磷酸、三乙胺為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

1.3? 實驗動物

蟾蜍140只，體質(zhì)量110～130 g，雌雄不拘，市場購買。本實驗的環(huán)境與設(shè)施條件符合中國國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》，動物實驗單位的許可證編號為SYXK（湘）2013-0005。

2 方法

2.1? 藥液的制備

實驗用藥液參照文獻[4-5]制備，其中，藥材∶水=1∶30，附子∶甘草=1∶1，浸泡30 min后回流提取1 h，然后用紗布過濾，在70 ℃下減壓濃縮，定容后制得1 mL含附子生藥量0.08 g的水煎液（合煎液、混合液中的甘草生藥量均為0.08 g）。實驗所需藥液均為新鮮制備。

2.2? 離體蛙心實驗

2.2.1? 分組與給藥? 將140只蟾蜍隨機分為4個藥物組，即模型組、附子煎液組、附子-甘草單煎混合液組、附子-甘草合煎液組，其中每個藥物組35只蟾蜍，每藥物組按相鄰劑量組等比設(shè)置7個濃度，每個藥物濃度5只蟾蜍。然后參照文獻[6-8]制備離體蛙心。 正常蛙心的給藥[9]：正常離體蛙心模型制備完成后，在蛙心套管內(nèi)加入1 mL的正常任氏液，先記錄一段時長為2 min的離體蛙心自主曲線，然后分別加入含附子生藥為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 g/mL的附子單煎液、附子-甘草單煎混合液、附子-甘草合煎液。加入蛙心套管內(nèi)的藥液體積為100 μL。加藥后記錄曲線2 min，完成一次給藥觀察后，更換離體蛙心，進行下一次給藥。心衰蛙心給藥[9]：離體蛙心模型制備完成后，先記錄一段正常曲線，然后將蛙心套管中的液體換成1 mL的低鈣任氏液，復(fù)制心衰蛙心模型，記錄離體蛙心在心衰情況下的2 min自主收縮曲線，即為心衰曲線。之后操作同上。正常蛙心模型和心衰蛙心模型均按上述方法給予相同體積的提藥用水。

2.2.2? 指標(biāo)檢測與數(shù)據(jù)記錄? 記錄蛙心心肌收縮曲線，計算蛙心的張力變化百分比，所得實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析。

2.3? 藥物HPLC指紋圖譜研究

2.3.1? 對照品溶液的制備? 精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、異甘草苷、甘草苷、次烏頭堿、異甘草素、甘草素、甘草酸對照品適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度分別為221.2、263.6、222.0、221.2、237.6、259.6、266.8、343.2、227.2 μg/mL的對照品儲備液，備用。

2.3.2? 供試品溶液的制備? 精密移取“2.1”下制備的藥液10 mL，水浴蒸干后，加適量甲醇溶解，洗滌，轉(zhuǎn)移并定容于10 mL容量瓶中，搖勻。取適量溶液置離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3? 色譜條件[10]? 色譜柱Agilent C18 4.6 mm×150? mm，5 μm）;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長通過全波長掃描，得出最佳波長為230 nm[11-12];運行時間70 min;進樣量為20 μL。以乙腈和0.2%磷酸+0.2%三乙胺為流動相，梯度洗脫程序見表1。

2.3.4? 精密度試驗? 精密吸取同一供試品溶液，在“2.3.3”色譜條件下連續(xù)進樣6次，各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.4%，各共有峰相對峰面積RSD均小于3.67%。

2.3.5? 重復(fù)性試驗? 取同一批次的附子-甘草合煎液，按“2.3.2”項下方法操作，平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.3”色譜條件下進樣測定。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.7%，相對峰面積的RSD均小于2.45%。

2.3.6? 穩(wěn)定性試驗? 精密吸取同一批次的附子-甘草合煎液的供試品溶液，在“2.3.3”色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、12 h 進行測定，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD均小于1.52%，各共有峰相對峰面積RSD均小于3.34%。

2.3.7? 指紋圖譜的建立與評價? 分別精密吸取10批附子和甘草單煎液的供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3.3”項下的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖;按照同樣的方法分別記錄其中1批附子-甘草藥材合煎液以及混合液的HPLC指紋圖譜;吸取“2.3.1”項下制備的9種對照品溶液，分成3組進樣測定（第1組：苯甲酰新烏頭堿，新烏頭堿，次烏頭堿，烏頭堿;第2組：甘草苷，Ⅵ異甘草苷;第3組：甘草素，異甘草素，甘草酸，因在該色譜條件下異甘草苷與甘草素的色譜峰難分離，故將與甘草成分的對照品分兩次進樣），得到3種混合對照品的色譜圖。

3 結(jié)果

3.1? 離體蛙心實驗

藥材煎液對正常組和心衰組離體蛙心的影響見表2和表3。藥物對正常離體蛙心作用的實驗結(jié)果顯示，附子與甘草配伍后，其強心作用比單用附子弱，附子-甘草合煎液可以增加蛙心的張力變化百分比，附子-甘草混合液對蛙心的張力變化百分比基本無影響。附子與甘草配伍可改善心衰蛙心的心功能：附子生藥量為1 mg時，合煎液即可達到最強藥效;而附子單煎液與混合液均在附子生藥量為4 mg時作用最強。附子單煎液、附子-甘草合煎液、附子-甘草混合液3個藥物組對離體蛙心的作用有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3.2? 藥物HPLC指紋圖譜研究

3.2.1? 指紋圖譜色譜峰的歸屬與指認(rèn)? 對10個不同批次附子和甘草藥材的單煎液、合煎液與混合液進行指紋圖譜檢測，并進行指標(biāo)成分的確認(rèn)。以上數(shù)據(jù)均采用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版本（國家藥典委員會）處理，結(jié)果如圖1-3。

由以上指紋圖譜可以看出，在圖1-3中標(biāo)記的31個峰中，1、2、3、5、10、12、13、18、19、20號峰來源于附子，其余峰來源于甘草;其中7號峰為甘草苷，15號峰為異甘草苷，16號峰為甘草素，18號峰為新烏頭堿，19號峰為次烏頭堿，20號峰為烏頭堿，21號峰為甘草酸，22號峰為異甘草素，33號峰為烏頭堿。與甘草單煎液相比，合煎液與混合液色譜圖中峰的數(shù)目基本無變化;而相比于附子單煎液，在藥對色譜圖中減少了兩個峰，即附子中的32號峰與33號峰（烏頭堿）消失。說明在此色譜條件下，未發(fā)現(xiàn)附子甘草配伍后有新成分產(chǎn)生，且合煎液與混合液色譜圖的峰數(shù)目一致。

3.2.2? 配伍前后指紋圖譜的變化? 為觀察附子-甘草合煎液與混合液指紋圖譜的差異，將對照指紋圖譜的各色譜峰與附子單煎液和甘草單煎液對照指紋圖譜的各色譜峰進行比較，分別計算其變化的百分比。見圖4。

指紋圖譜中的峰面積與成分的含量呈正相關(guān)性，故可以通過對比配伍前后峰面積的變化來估計成分的含量變化。指紋圖譜對比顯示，配伍后，甘草中的異甘草苷（15號峰）、甘草素（16號峰）與異甘草素（22號峰）成分含量均升高，甘草酸（23號峰）無明顯變化，附子中的烏頭堿成分（33號峰）和32號峰代表的成分消失?？傮w而言，合煎液和混合液中的成分變化差別較復(fù)雜，未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。與甘草單煎液相比，合煎液中大部分甘草相關(guān)成分含量有所升高，但甘草苷（7號峰）以及26號峰、30號峰、31號峰代表的成分含量大幅度降低;混合液中甘草苷含量升高，20號峰代表的成分含量降低，而其他大多數(shù)甘草相關(guān)成分增多或無明顯改變。與附子單煎液相比，合煎液中的3號峰與5號峰代表的附子相關(guān)成分含量有明顯的上升趨勢，而在混合液中，3號峰代表的成分無明顯變化，5號峰代表的成分含量呈下降趨勢。

以上結(jié)果表明，附子與甘草配伍后，其合煎液與單煎液的混合液的成分變化不一致。

4 討論

4.1? 色譜條件的選擇

參考文獻[13-14]資料并結(jié)合預(yù)實驗，本實驗以乙腈和0.2%磷酸+0.2%三乙胺為流動相進行梯度洗脫，樣品利用DAD 檢測器進行全波段掃描檢測分析。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品在230、250、337、360 nm檢測處都有比較顯著的特征色譜峰，其中以230 nm為檢測波長時所得色譜圖指紋信息最好，因此本實驗選取230 nm作為檢測波長。在上述分離檢測條件下，附子單煎液樣品，附子-甘草合煎液與混合液樣品均在70 min內(nèi)出峰完畢，且分離度良好。

4.2? 結(jié)果分析

本實驗在用藥劑量及配伍比例、藥材浸泡、煎煮時間和濃縮條件相同的情況下，通過離體蛙心實驗和HPLC指紋圖譜比較了附子-甘草藥合煎液與混合液的藥效和物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，對離體正常蛙心，合煎液可以緩和附子的強心作用，混合液則無明顯影響。對離體心衰蛙心，附子與甘草配伍后可以明顯增強藥效，合煎可使附子在較低生藥量（1 mg）時達到最高藥效，而單煎液與混合液均含附子為4 mg時方可達到最高藥效。

藥物指紋圖譜研究顯示附子甘草配伍前后成分有變化，但未發(fā)現(xiàn)新的化合物;另合煎液與混合液的指紋圖譜差異顯著：各指標(biāo)成分的峰面積均有差別，并且甘草苷以及5號、20號、30號、31號峰代表的成分變化是相反的。上述結(jié)果提示，指紋圖譜上這些成分變化是附子、甘草合煎液與混合液藥效差異的物質(zhì)基礎(chǔ)。但這些色譜峰所代表的成分、具體的化學(xué)反應(yīng)差別及其原因，以及這些成分對離體蛙心的具體作用還有待研究。

4.3? 小結(jié)

根據(jù)文獻報道，甘草對附子的減毒增效主要與附子與甘草中各成分間的相互反應(yīng)或作用密切相關(guān)[15]，故本實驗將附子-甘草合煎液與混合液進行對比研究。實驗發(fā)現(xiàn)附子-甘草的合煎液與混合液，無論在化學(xué)成分、成分含量以及藥效上均有差別。合煎液與混合液中產(chǎn)生的成分變化差別可能是由于成分間產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)不同。為進一步闡明附子、甘草配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)，可在本研究基礎(chǔ)上，通過UPLC-MS、NMR等手段對合煎液與混合液中未辨別的色譜峰進行定性定量研究。

湯劑是中藥臨床應(yīng)用的傳統(tǒng)劑型和主要形式，中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取濃縮制成，供中醫(yī)臨床配方用的顆粒。中藥復(fù)方的配方顆粒雖方便病人服用，但與傳統(tǒng)合煎湯劑相比，其有效成分的含量有明顯區(qū)別[16-19]，量效關(guān)系、毒效關(guān)系均有待評估[20]。本研究結(jié)果還提示，為使中藥配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑等效且確保安全性，其臨床用量需經(jīng)科學(xué)研究加以論證。

參考文獻

[1] 陳榮昌，孫桂波，張? 強，等.附子毒性研究進展[J].中國中藥雜志，2013，38（8）：1126-1129.

[2] 曹明成，黃泰康.我國有毒中藥的研究進展綜述[J].中國藥業(yè)，2016，25（2）：9-13.

[3] 王律韻，楊潔紅，張宇燕，等.附子與甘草配伍減毒增效的物質(zhì)基礎(chǔ)初探[J].中國中醫(yī)急癥，2011，20（2）：248-250.

[4] 張? 丹，葉? 強.附子配伍不同甘草炮制品及其比例的研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（13）：1102-1104.

[5] 張廣平，解素花，朱曉光，等.附子甘草配伍減毒增效/存效實驗研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（6）：31-34.

[6] 齊梁煜，黃月維，韋家河，等.王不留行醇提物和水提物對離體蛙心的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43（10）：1873-1876.

[7] 汪? 洋，唐澤耀，王珂萌，等.茶色素對離體蟾蜍心肌收縮力的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（12）：90-94.

[8] 呂云瑤，王興娜，張夢蕓，等.洋蔥醇提物對離體蟾蜍心臟功能的影響[J].西部中醫(yī)藥，2018，31（3）：15-18.

[9] 鄧家剛，范麗麗，郝二偉，等.附子的回陽救逆量效關(guān)系研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：150-154.

[10] HUANG W W， WANG M Y， SHI H M， et al. Comparative study of bioactive constituents in crude and processed Glycyrrhizae radix and their respective metabolic profiles in gastrointestinal tract in vitro by HPLC-DAD and HPLC-ESI/MS analyses[J]. Archives of Pharmacal Research，2012，35（11）：1945-1952.

[11] CSUPOR D， BORCSA B， HEYDEL B， et al. Comparison of a specific HPLC determination of toxic aconite alkaloids in processed Radix aconiti with a titration method of total alkaloids[J]. Pharmaceutical Biology， 2011， 49（10）：1097-1101.

[12] NIELSEN N P V， CARSTENSEN J M， SMEDSGAARD J. Aligning of single and multiple wavelength chromatographic profiles for chemometric data analysis using correlation optimised warping[J]. Journal of Chromatography A， 1998， 805（1/2）：17-35.

[13] CSUPOR D， BORCSA B， HEYDEL B， et al. Comparison of a specific HPLC determination of toxic aconite alkaloids in processed Radix aconiti with a titration method of total alkaloids.[J]. Pharmaceutical Biology， 2011， 49（10）：1097-1101.

[14] 王文鵬，馮玉康，郝鵬彬，等.甘草提取物HPLC指紋圖譜及質(zhì)量評價研究[J].西部中醫(yī)藥，2017，30（11）：52-55.

[15] 何? 瑤，章津銘，高? 飛，等.附子甘草配伍減毒增效作用機制研究進展及展望[J].中藥與臨床，2013，4（3）：62-65.

[16] 張斐姝，蔡舒婷，舒? 忻，等.中藥配方顆粒的臨床運用概況與未來趨勢[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（16）：70-73.

[17] 何書芬，張? 倩，朱立靜，等.四逆湯配方顆粒煎煮前后6種成分的含量變化研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2016，24（4）：308-311.

[18] 郝云芳.苓桂術(shù)甘湯傳統(tǒng)湯劑、復(fù)方顆粒劑、配顆粒劑化學(xué)成分與藥效對比研究[D].太原：山西省中醫(yī)藥研究院，2014.

[19] 史? 蕙，黃? 蓓.HPLC對戊己丸傳統(tǒng)湯劑與其復(fù)方、配方顆粒湯劑的特征圖譜比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（21）：86-94.

[20] 鹿? 巖，李? 妮，段夢雅，等.2010-2013年357種中藥配方顆粒的臨床使用分析[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29（9）：1050-1053.