程冬梅　張志勇　周賽霞　彭焱松　張兆祥

摘要：? 冬季低溫脅迫對(duì)亞熱帶常綠闊葉樹光合活性的主要影響之一，體現(xiàn)在光合機(jī)構(gòu)的低溫光抑制。為了闡明冬季低溫脅迫下常綠闊葉樹光系統(tǒng)Ⅱ的光抑制程度及光保護(hù)機(jī)制，該文研究了冬季自然低溫脅迫（零下低溫凍害和零上低溫寒害）對(duì)紅葉石楠、枇杷和猴樟三種亞熱帶常綠闊葉樹光合機(jī)構(gòu)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）光抑制的影響以及春季氣溫回暖后的恢復(fù)情況。結(jié)果表明：凍害和寒害低溫脅迫使猴樟的PSⅡ活性顯著降低，PSⅡ受到較嚴(yán)重的光抑制，低溫脅迫解除后PSⅡ活性未能完全恢復(fù)。紅葉石楠PSⅡ活性下降程度和光抑制程度最輕，春季PSⅡ活性顯著上升，光抑制顯著下降。枇杷PSⅡ活性和光抑制程度介于猴樟和紅葉石楠之間。低溫脅迫下紅葉石楠的非光化學(xué)猝滅（NPQ）接近常溫水平;枇杷的NPQ略有降低，春季恢復(fù)正常;猴樟NPQ最低，春季低溫解除后仍不能完全恢復(fù)。此外，三種常綠闊葉樹在冬季低溫脅迫和春季恢復(fù)時(shí)期的NPQ與PSⅡ的光抑制程度存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜合以上結(jié)果分析表明，冬季低溫對(duì)紅葉石楠PSⅡ影響不大，對(duì)枇杷有一定影響但春季氣溫回暖后可以及時(shí)恢復(fù)，對(duì)猴樟PSⅡ有顯著的光抑制且恢復(fù)過(guò)程較慢，同時(shí)NPQ對(duì)保護(hù)常綠闊葉樹PSⅡ免受冬季低溫光抑制有重要的貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞： 光合作用生理， 光系統(tǒng)Ⅱ， 光抑制， 低溫脅迫， 非光化學(xué)淬滅， 光保護(hù)

中圖分類號(hào)：? Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2019）12-1666-07

Abstract：? The limits on photosynthesis of subtropical evergreen trees imposed by winter low temperature are mainly from photoinhibition of photosynthetic apparatus. To understand the extent of photoinhibition of photosystem Ⅱ （PS Ⅱ） and the mechanism of photoprotection of evergreen trees under winter low temperature stress， PS Ⅱ photoinhibition and recovery were studied in three broad-leaved evergreen tree species Photinia × fraseri， Eriobotrya japonica and Cinnamomum bodinieri. The results were as follows： PS Ⅱ of Cinnamomum bodinieri was severely depressed and suffered photoinhibition under freezing and chilling temperature， and function of PS Ⅱ was unable to fully recover at spring normal temperature. Photinia × fraseri showed the most unaffected PS Ⅱ function and the least photoinhibition， whereas the situation in Eriobotrya japonica was in the intermediate. Accordingly， Photinia × fraseri maintained the level of non-photochemical quenching （NPQ） almost as high as at normal temperature， and NPQ of Eriobotrya japonica showed a little decrease but recovered at normal temperature condition. Cinnamomum bodinieri displayed the lowest NPQ under low temperature and was unable to totally recover. Furthermore， all the three tree species showed a strong negative relationship between NPQ and PS Ⅱ photoinhibition， which was indicated by the maximum potential photochemical efficiency of PS Ⅱ （Fv/Fm） and the quantum yield of non-regulated energy dissipation of PS Ⅱ [Y（NO）]. Overall， the results demonstrate that Photinia × fraseri is more resistant to low temperature stress than Eriobotrya japonica and Cinnamomum bodinieri in terms of PS Ⅱ. At the same time， NPQ plays an important role for protecting PS Ⅱ of these trees from photoinhibition under low temperature.

Key words： physiology of photosynthesis， photosystem Ⅱ （PS Ⅱ）， photoinhibition， low temperature stress， non-photochemical quenching （NPQ）， photoprotection

低溫是限制植物地理分布和生理活動(dòng)的重要環(huán)境因素（Sharma et al.， 2005; Ensminger et al.， 2012）。低溫凍害和寒害不僅造成植物細(xì)胞水分結(jié)晶、滲透壓改變、膜系統(tǒng)受損，還導(dǎo)致酶活性降低、代謝變緩、光合機(jī)構(gòu)受氧化脅迫活性降低（Graham & Patterson， 1982; quist & Hüner， 2003）。葉綠體類囊體膜上的光合機(jī)構(gòu)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）對(duì)環(huán)境變化最為敏感（Aro et al.， 1993; Tyystjrvi， 2013），當(dāng)植物在低溫等環(huán)境脅迫條件下吸收和傳遞過(guò)剩光能，產(chǎn)生的大量活性氧使PSⅡ反應(yīng)中心D1蛋白氧化損傷速率大于修復(fù)速率，導(dǎo)致光化學(xué)效率降低，引起光抑制現(xiàn)象（Vass & Cser， 2009; Sonoike， 2011; 楊萬(wàn)基等， 2018）。非光化學(xué)猝滅（NPQ）是植物應(yīng)對(duì)氧化脅迫的重要防御機(jī)制，捕光天線復(fù)合物將吸收的過(guò)剩光能以熱能耗散，避免活性氧的積累（Takahashi & Murata， 2008; Murchie & Niyogi， 2011; Pinnola & Bassi， 2018）。

不同于落葉樹，常綠樹在冬季仍保留葉片進(jìn)行光合作用，低溫使CO2固定相關(guān)酶活性降低，NADPH還原力積累，導(dǎo)致葉綠體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（Sharma et al.， 2005; Verhoeven， 2013）。因此，大部分松柏類常綠樹在冬季PSⅡ活性顯著降低，NPQ受調(diào)控顯著上升（Bigras et al.， 2001; Derks et al.， 2015）。這種PSⅡ冬季持續(xù)性光抑制現(xiàn)象是植物應(yīng)對(duì)冬季低溫的一種重要的保護(hù)機(jī)制（quist & Hüner 2003; Míguez et al.， 2017）。近年來(lái)研究報(bào)道，零上低溫對(duì)熱帶、亞熱帶常綠闊葉樹PSⅡ發(fā)生顯著的光抑制（胡文海等，2005; Huang et al.， 2010; Li et al.， 2018）。但是目前對(duì)紅葉石楠（Photinia × fraseri）、枇杷（Eriobotrya japonica）、猴樟（Cinnamomum bodinieri）等亞熱帶常綠闊葉樹在零下低溫凍害后PSⅡ的光抑制程度以及NPQ在光保護(hù)作用方面的報(bào)道仍比較少見(jiàn)。本文主要研究了紅葉石楠、枇杷、猴樟三種常綠闊葉樹在低溫凍害和寒害脅迫下PSⅡ的光抑制及活性恢復(fù)，并對(duì)NPQ在保護(hù)PSⅡ免受光抑制中的作用進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1 植物材料

以江西省中國(guó)科學(xué)院廬山植物園分園鄱陽(yáng)湖植物園（116°5.2′ E，29°40.5′ N，海拔25 m）種植的八年生成熟的紅葉石楠（Photinia × fraseri）、枇杷（Eriobotrya japonica）和猴樟（Cinnamomum bodinieri）為研究材料，分別于2018年冬春季節(jié)低溫脅迫和恢復(fù)期間上午09：00—11：00取向陽(yáng)面同一位置成熟枝葉，暗適應(yīng)30 min后立即用LI-COR 6800便攜式光合儀對(duì)葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定。每種材料至少進(jìn)行3個(gè)葉片重復(fù)觀測(cè)。

1.2 溫度條件

2018年1月27日至30日鄱陽(yáng)湖植物園遭受連續(xù)降雪和凍雨導(dǎo)致的零下低溫凍害;2月8日氣溫回升至零上低溫寒害;4月9日氣溫基本恢復(fù)正常，可作為低溫脅迫解除和光合活性恢復(fù)的對(duì)照條件。分別于1月30、2月8日、4月9日進(jìn)行試驗(yàn)，三天的日最低氣溫分別為-5.3、4.5、9.2 ℃，日平均氣溫分別為-1.1、7.2、18.5 ℃。氣溫?cái)?shù)據(jù)由植物園氣象站觀測(cè)獲得。

1.3 葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)

暗適應(yīng)葉片觀測(cè)最小熒光Fo和10 000 μmol photons·m-2·s-1飽和脈沖下最大熒光Fm，并計(jì)算PSⅡ潛在最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm=（Fm-Fo）/ Fm。然后開啟光化光，檢測(cè)光適應(yīng)時(shí)最小熒光Fo′、最大熒光Fm′和穩(wěn)態(tài)熒光Fs，分別計(jì)算PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量Φ（Ⅱ）=（Fm′-Fs）/Fm′;PSⅡ相對(duì)電子傳遞速率rETR（Ⅱ）=光合有效輻射（PAR）× Φ（Ⅱ）×0.84×0.5;非光化學(xué)猝滅NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′;qN=1-（Fm′-Fo′）/（Fm-Fo）;PSⅡ非調(diào)節(jié)性能量耗散量子產(chǎn)量Y（NO）=Fs/Fm。將葉片在0、25、50、100、150、300、500、1 000、1 500、2 000 μmol photons·m-2 ·s-1光合有效輻射下保持90～120 s，測(cè)得各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的快速光響應(yīng)曲線。

1.4 曲線擬合

根據(jù)Jasby & Platt（1976）的方程P=Pm×tanh （α×PAR/Pm）對(duì)rETR（Ⅱ）快速光響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合。其中：α為曲線的初始斜率，反映了光能利用效率;Pm是擬合出來(lái)的潛在最大相對(duì)電子傳遞速率;半飽和光強(qiáng)Ik=Pm/α，反映了樣品耐受強(qiáng)光的能力。曲線用最小二乘法通過(guò)Origin 8.5軟件擬合。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2015軟件統(tǒng)計(jì)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Origin 8.5軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 PSⅡ的活性變化

圖1為零下低溫凍害（1月30日）、零上低溫寒害（2月8日）和恢復(fù)（4月9日）時(shí)期紅葉石楠、枇杷和猴樟PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量Φ（Ⅱ）和PSⅡ相對(duì)電子傳遞速率rETR（Ⅱ）的光響應(yīng)曲線，以此來(lái)反映低溫對(duì)PSⅡ活性的影響。結(jié)果顯示，凍害使三種樹PSⅡ的活性都受到不同程度的下降。紅葉石楠凍害后Φ（Ⅱ）與恢復(fù)期接近，rETR（Ⅱ）保持較高水平，甚至高于恢復(fù)時(shí)期。枇杷凍害后的Φ（Ⅱ）和rETR（Ⅱ）比紅葉石楠略低。猴樟PSⅡ受影響最嚴(yán)重，Φ（Ⅱ）和rETR（Ⅱ）最低。零上低溫寒害下三種樹的PSⅡ活性仍維持在凍害時(shí)期的水平甚至更低。春季氣溫回升至18.5 ℃后（4月9日），紅葉石楠和枇杷Φ（Ⅱ）恢復(fù)至正常水平，而猴樟Φ（Ⅱ）與rETR（Ⅱ）不能全部恢復(fù)。對(duì)rETR（Ⅱ）快速光響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合后，猴樟初始斜率α和最大光合速率Pm在低溫脅迫時(shí)明顯低于紅葉石楠和枇杷，溫度恢復(fù)后猴樟最大光合速率Pm和耐受強(qiáng)光的能力Ik仍然低于紅葉石楠和枇杷（表1）。

2.2 PSⅡ的光抑制及恢復(fù)

圖2顯示了低溫脅迫及恢復(fù)過(guò)程中三種樹PSⅡ光抑制變化。凍害和寒害下紅葉石楠維持較高的Fv/Fm和較低的Y（NO），表明PSⅡ僅受到輕微的光抑制，且在溫度恢復(fù)正常后光抑制也完全恢復(fù)。凍害使枇杷的Fv/Fm和Y（NO）分別低于和高于紅葉石楠，寒害下枇杷的PSⅡ光抑制有所減輕，氣溫恢復(fù)后PSⅡ的光抑制也得到完全恢復(fù)。凍害對(duì)猴樟的PSⅡ產(chǎn)生非常顯著的光抑制，F(xiàn)v/Fm和Y（NO）分別達(dá)到了最低和最高值，而且光抑制程度隨著凍害的解除和冷害的持續(xù)而繼續(xù)加深，直到氣溫恢復(fù)正常后光抑制程度才有部分恢復(fù)。

2.3 NPQ與PSⅡ光抑制的關(guān)系

非光化學(xué)猝滅（NPQ）是植物進(jìn)行光保護(hù)的重要機(jī)制，可以通過(guò)葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ和qN來(lái)反映。圖3顯示了紅葉石楠、枇杷和猴樟在零下低溫凍害、零上低溫寒害和氣溫恢復(fù)時(shí)期葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ和qN的光響應(yīng)曲線變化。結(jié)果顯示凍害和寒害脅迫下三種樹的NPQ和qN均有不同程度的降低，氣溫恢復(fù)后NPQ和qN也隨之得到不同程度的恢復(fù)。相對(duì)而言，凍害和寒害低溫脅迫對(duì)紅葉石楠的NPQ和qN影響較小，枇杷NPQ圖 1紅葉石楠、枇杷和猴樟在凍害（1月30日）、寒害（2月8日）、春季常溫（4月9日）下PSⅡ活性變化和qN低于紅葉石楠，猴樟的NPQ和qN最低。氣溫恢復(fù)后，紅葉石楠和枇杷的NPQ和qN均恢復(fù)到較高水平，猴樟的NPQ和qN仍不能完全恢復(fù)。將凍害、寒害、正常溫度三種條件下紅葉石楠、枇杷和猴樟的Fv/Fm與500 μmol photons·m-2·s-1光合有效輻射下的NPQ、Y（NO）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三種樹在三種條件下Y（NO）和Fv/Fm均與NPQ存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即PSⅡ光抑制程度與非光化學(xué)猝滅存在顯著負(fù)相關(guān)（圖4）。

3討論與結(jié)論

凍害和寒害脅迫對(duì)越冬的常綠闊葉樹的PSⅡ產(chǎn)生光抑制，是導(dǎo)致冬季樹木光合活性下降的重要原因（Verhoeven， 2013）。低溫光照條件下產(chǎn)生的活性氧對(duì)光合機(jī)構(gòu)和其他生物大分子造成氧化損傷，不僅使光合作用活性下降，而且導(dǎo)致葉片黃化、褐化、壞死（Sharma et al.， 2005）。該試驗(yàn)對(duì)紅葉石楠、枇杷、猴樟在冬季凍害和寒害低溫脅迫下PSⅡ的光抑制和恢復(fù)進(jìn)行了研究，證明冬季低溫對(duì)三種亞熱帶常綠闊葉樹PSⅡ造成的光抑制存在差異。綜合而言，低溫對(duì)紅葉石楠PSⅡ的影響最小，枇杷次之，猴樟PSⅡ受到顯著的光抑制且恢復(fù)較慢。 三種樹的PSⅡ光抑制程度與NPQ的活性存在負(fù)相關(guān)。

研究證明，F(xiàn)v/Fm和Y（NO）可以有效反映PSⅡ的光抑制程度（Baker， 2008; Huang et al.， 2010; Míguez et al.， 2015）。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示，三種常綠闊葉樹在低溫脅迫和恢復(fù)時(shí)期PSⅡ活性越高，F(xiàn)v/Fm越高，Y（NO）越低，證實(shí)了這兩個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以真實(shí)有效地反映PSⅡ光抑制的生理狀態(tài)。紅葉石楠在低溫脅迫下PSⅡ活性未受顯著下降，而rETR（Ⅱ）在春季氣溫恢復(fù)后卻表現(xiàn)出下降（圖1），原因可能是受恢復(fù)時(shí)期Φ（Ⅱ）光響應(yīng)曲線隨著光合有效輻射的增加而迅速下降所影響，因?yàn)閞ETR（Ⅱ）的計(jì)算結(jié)果由光合有效輻射和Φ（Ⅱ）共同決定。

盡管三種樹在低溫脅迫下PSⅡ活性下降程度不同，但Fv/Fm均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，Y（NO）均有上升趨勢(shì)，即PSⅡ都發(fā)生了不同程度的光抑制，這表明三種常綠闊葉樹在冬季進(jìn)行了PSⅡ持續(xù)性光抑制的保護(hù)機(jī)制。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了Míguez et al.（2015）越冬常綠植物普遍在氣溫閾值為0 ℃ 發(fā)生PS Ⅱ持續(xù)性光抑制的結(jié)論。下一步研究低溫脅迫對(duì)PS I光抑制的影響將進(jìn)一步闡明PSⅡ與PS I在低溫脅迫下的光抑制特性與相互關(guān)系。

綜上所述，冬季凍害和寒害對(duì)紅葉石楠、枇杷和猴樟三種亞熱帶常綠闊葉樹PSⅡ產(chǎn)生不同程度的光抑制，而且非光化學(xué)猝滅的光保護(hù)機(jī)制對(duì)越冬常綠樹種PSⅡ免受低溫光抑制具有重要的生理學(xué)意義。

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