加速溶劑萃?。咝б合嗌V-熒光法檢測鴿蛋和鶴鶉蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留

刁志祥 王波 張培楊 王旭堂 謝愷舟 趙霞

摘要：【目的】建立鴿蛋和鶴鶉蛋中尼考（florfenicol，F(xiàn)F）及其主要代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）殘留檢測的加速溶劑萃取/超高效液相色譜-熒光檢測（ASE/UPLC-FLD）法，為動(dòng)物源性食品中FF和FFA殘留檢測提供新的安全可靠的方法?！痉椒ā坎捎眉铀偃軇┹腿。ˋSE）法，用乙腈：氨水（98：2，V/V）為提取劑萃取樣品，用乙腈飽和的正己烷去脂進(jìn)行純化，使用由0.005mol·L^-1NaH₂PO₄，0.003mol·L^-1十二烷基硫酸鈉和0.05%三甲胺組成的流動(dòng)相供UPLC-FLD檢測。【結(jié)果】鴿蛋和鵪鶉蛋中FF和FFA在定量限（LOQ）～400μg·kg^-1范圍內(nèi)，目標(biāo)物的峰面積與其濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R²）均大于0.9992。樣品在LOQ、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1的加標(biāo)水平下的平均回收率為84.69%～98.04%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于3.7%。鴿蛋中FF的檢測限（LOD）和LOQ為4.8μg·kg^-1和11.2μg·kg^-1，F(xiàn)FA的LOD和LOQ為1.9μg·kg^-1和4.8μg·kg^-1;鵪鶉蛋中FF的LOD和LOQ為4.7μg·kg^-1和10.6μg·kg^-1，F(xiàn)FA的LOD和LOQ為1.8μg·kg^-1，和4.6μg·kg^-1。【結(jié)論】該方法快速、簡單、靈敏度高，適合禽蛋中FF及其代謝產(chǎn)物FFA的檢測。

關(guān)鍵詞：鴿蛋;鶴鶉蛋;氟苯尼考;氟苯尼考胺;加速溶劑萃取;超高效液相色譜-熒光法

中圖分類號(hào)：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）11-1315-08

0 引言

【研究意義】氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）是甲礬霉素和氯霉素的氟化類似物，是抗生素類藥物家族中具有廣泛抗菌譜的新型半合成成員，對眾多革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等具有顯著的抑制效果，且有著抗菌活性強(qiáng)、廉價(jià)高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)的疾病治療中[1]。歐盟規(guī)定FF藥物在禽蛋中的最高殘留限量（Maximumresidue limit，MRL）為100μg·kg^-1[2]。禽蛋作為來源最廣、蛋白質(zhì)含量較高的動(dòng)物性食品，人們對其日常需求量非常大，近年來隨著生活水平的提高，鴿蛋和鵪鶉蛋也漸漸走上餐桌，占據(jù)禽蛋市場不小的份額，而許多不法養(yǎng)殖者為了提高經(jīng)濟(jì)效益，將FF等藥物不合理使用，以致FF及其主要代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）過量殘留在鴿蛋和鵪鶉蛋中，增加了消費(fèi)者患再生障礙性貧血和耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的健康[3-4]。因此建立鴿蛋和鶴鶉蛋中FF和FFA殘留的檢測方法對于保障消費(fèi)者身體健康和進(jìn)出口貿(mào)易順利進(jìn)行具有重要的實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外對FF及FFA殘留檢測的方法主要包括：酶聯(lián)免疫法（ELISA）[5-6]、液相色譜法（LC）[7-8]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）[9-12]和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS/MS）[13-14]等，有的方法[9，12]只檢測FF一種藥物，而FFA作為FF的標(biāo)志性殘留物，歐盟規(guī)定FF的殘留量以其自身和FFA的總量計(jì);雖然液一液提取法不需要復(fù)雜的提取設(shè)備，儀器成本低，但其操作過程繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力且誤差較大，浪費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，同時(shí)對實(shí)驗(yàn)人員身體健康有一定的損害。加速溶劑萃?。ˋSE）在高溫高壓條件下減小了目標(biāo)物和樣品基質(zhì)之間的相互作用力，實(shí)現(xiàn)了提取劑與目標(biāo)物更好的接觸，提高萃取效率，因此ASE法具有快速全自動(dòng)、回收率高、溶劑使用量小、重現(xiàn)性好、可批量處理樣品等優(yōu)點(diǎn)，故本試驗(yàn)采用ASE提取法進(jìn)行樣品前處理[15]。使用最多的檢測方法就是質(zhì)譜法（MS）[10]，MS雖然定性定量準(zhǔn)確，靈敏度高，但儀器價(jià)格昂貴，檢測成本高;在滿足檢測要求的前提下開發(fā)新的、低成本檢測方法十分必要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綜合國內(nèi)外研究，目前采用加速溶劑萃取結(jié)合超高效液相色譜一熒光檢測法（ASE/UPLC-FLD）對鴿蛋和鶴鶉蛋中FF和FFA殘留同時(shí)檢測的方法尚未見報(bào)道，且我國也尚未建立蛋品中同時(shí)檢測FF和FFA殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)采用ASE法提取樣品，再用乙腈飽和的正己烷去脂，以乙腈：氨水（98：2，VN）為提取劑，建立鴿蛋、鶴鶉蛋中FF和 FFA殘留檢測的UPLC-FLD法，為鶴鶉蛋和鴿蛋中FF和FFA殘留檢測提供新的檢測方法、技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 試驗(yàn)樣品為35周齡產(chǎn)蛋家鴿50只（江蘇江南鴿業(yè)有限公司）和20周齡產(chǎn)蛋鶴鶉30只（興化市安豐鎮(zhèn)鶴鶉養(yǎng)殖有限公司），試驗(yàn)前預(yù)飼2周不添加任何藥物的全價(jià)飼料，每天取蛋放入低溫蛋庫中，最后將全蛋勻漿后分裝保存于-34℃冰箱中備用。

1.1.2 儀器及試劑 Acquity UPLC超高效液相色譜儀（配有熒光檢測器，Waters公司）;ASE350型加速溶劑萃取儀（Thermo Fisher公司）;58108型高速冷凍離心機(jī)（Eppendof公司）;離心濃縮儀（LaboGene公司）;Mettler Toledo FE20型pH計(jì)（梅特勒一托利多儀器有限公司）。

FF標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH有限公司）;FFA標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.8%，WITEGALaboratorien Berlin-Adlershof GmbH有限公司;乙腈、三乙胺均為色譜純;磷酸二氫鈉、磷酸、己烷、氨水、十二烷基硫酸鈉等均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 FF標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取FF標(biāo)準(zhǔn)品4.04mg（因純度≥99.0%，故實(shí)際FF含量為4.00mg），用乙腈定容至10mL，配制成400.0mg·L^-1的FF標(biāo)準(zhǔn)溶液。FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取FFA標(biāo)準(zhǔn)品1.01mg（純度>99.8%，故實(shí)際FFA含量為1.00mg），先用1mL超純水溶解后用乙腈定容至10mL，配制成100.0mg·L^-1的FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的提取與凈化 準(zhǔn)確稱取鴿蛋和鶴鶉蛋空白樣品（2.0±0.02）g放入適量硅藻土中，研磨混合均勻后裝入萃取池中進(jìn)行加速溶劑萃取，使用的萃取劑為乙腈：氨水（98：2，V/V），萃取壓力為1500psi，80℃下萃取3min，萃取劑的用量控制在萃取池體積的40%左右，樣品間自動(dòng)沖洗1次，氮?dú)獯祾?0s并靜態(tài)循環(huán)2次。使用離心濃縮儀將收集的萃取液濃縮近干，分別向其中加入1mL乙腈渦旋震蕩溶解殘?jiān)?，再加?mL乙腈飽和的正己烷去脂，再次濃縮至干備用。用2.0mL流動(dòng)相將濃縮干后的樣品復(fù)溶并渦旋1min，12100g轉(zhuǎn)速下離心15min后過0.22μm聚偏氟乙烯針式濾器，濾液供UPLC-FLD系統(tǒng)檢測。

1.2.3 超高效液相色譜條件 色譜柱為AcquityUPLC?BEH C₁₈柱（2.1mm×100mm，1.7μm）;流動(dòng)相A：超純水（含0.005mol·L^-1NaH^-1PO₄溶液，0.05%的三乙胺和0.003mol·L^-1十二烷基硫酸鈉，用85%H₃PO₄調(diào)pH至5.3±0.1）;流動(dòng)相B：乙腈;洗脫方式：流動(dòng)相A：B=64：36等度洗脫;熒光檢測器的激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為233nm和284nm;流速：0.2mL·min^-1;進(jìn)樣體積：10μL;柱溫：30℃。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取適量鴿蛋和鶴鶉蛋空白樣品按1.2.2的方法處理并添加一定濃度的FF和FFA標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得對應(yīng)鴿蛋和鵪鶉蛋基質(zhì)中FF的添加質(zhì)量比為LOQ、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0μg·kg^-1，F(xiàn)FA的添加質(zhì)量比為LOQ、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0μg·kg^-1，再將各濃度樣品通過UPLC-FLD系統(tǒng)檢測并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品回收率測定 準(zhǔn)確稱取勻漿好的鴿蛋和鶴鶉蛋空白樣品（2.0±0.02）g，與適量硅藻土混合研磨均勻，加入FF和FFA標(biāo)準(zhǔn)工作液使得對應(yīng)鴿蛋基質(zhì)中FF的添加質(zhì)量比為11.2、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1，F(xiàn)FA的添加質(zhì)量比為4.8、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1;對應(yīng)鶴鶉蛋基質(zhì)中FF的添加質(zhì)量比為10.6、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1，F(xiàn)FA的添加質(zhì)量比為4.6、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1，每個(gè)添加水平設(shè)置6個(gè)平行，攪拌混勻填入萃取池，經(jīng)萃取凈化后供UPLC-FLD檢測，最后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得濃度，并計(jì)算樣品回收率。

1.2.6 精密度測定 精密度可用來表示測量方法的再現(xiàn)性，是試驗(yàn)準(zhǔn)確性的重要參數(shù)之一。在同一天內(nèi)進(jìn)行6次重復(fù)測定，求出日內(nèi)RSD;在不同天重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，求出日間RSD。

1.2.7 檢測限和定量限測定 在本試驗(yàn)建立的方法條件下，取空白樣品進(jìn)行添加回收分析試驗(yàn)，每個(gè)濃度分析3次，當(dāng)信噪比值大于等于3（S/N≥3）時(shí)所對應(yīng)的添加濃度即為分析方法的檢測限（limit ofdetection，LOD）;當(dāng)信噪比值大于等于10（S/N≥10）時(shí)所對應(yīng)的添加濃度即為分析方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取劑提取FF和FFA的回收率

本試驗(yàn)對鴿蛋和鶴鶉蛋樣品基質(zhì)中不同比例氨水氨化的乙腈（99：1，98：2，97：3，96：4，95：5）對目標(biāo)物提取效果進(jìn)行對比，其結(jié)果見表1。表明萃取劑乙腈：氨水（98：2，V/V）時(shí)提取效果最好，兩種目標(biāo)藥物回收率均大于92.00%。

2.2 色譜圖

如圖1A-E所示，在UPLC-FLD檢測條件下，目標(biāo)物FF和FFA在鴿蛋和鶴鶉蛋樣品基質(zhì)中均與雜質(zhì)分離，峰形較好，出峰時(shí)間分別在2.1min和3.8min左右，無干擾雜峰。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限的確定

如圖2和圖3可得，在空白鴿蛋樣品中，F(xiàn)F和FFA的添加質(zhì)量比分別在11.2～400.0μg·kg^-1和4.8～400.0μg·kg^-1，其峰面積與質(zhì)量比呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y=762.75x+795.56和y=4019.2x+540.28，相關(guān)系數(shù)分別為0.9992和0.9998 ;在空白鶴鶉蛋樣品中，F(xiàn)F和FFA的添加質(zhì)量比分別在10.6～400.0μg·kg^-1和4.6～400.0μg·kg^-1，其峰面積與質(zhì)量比呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y=753.91x-163.29和y=4824.5x-184.02，對應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9994。在鴿蛋中，F(xiàn)F的LOD為4.8μg·kg^-1，LOQ為11.2μg·kg^-1;FFA的LOD為1.9μg·kg^-1，LOQ為4.8μg·kg^-1;鵪鶉蛋中FF的LOD為4.7μg·kg^-1，LOQ為10.6μg·kg^-1;FFA的LOD為1.8μg·kg^-1，LOQ為4.6μg·kg^-1。結(jié)果表明，此方法靈敏度高，完全滿足鶴鶉蛋和鴿蛋中FF和FFA殘留檢測的要求，滿足歐盟2002/675/EC[2]決議關(guān)于多種藥物殘留檢測中方法論證參數(shù)的要求。

2.4 空白基質(zhì)添加FF和FFA的回收率和精密度

空白鴿蛋和鶴鶉蛋中FF和FFA的加標(biāo)回收率及精密度見表2和表3。在鴿蛋樣品中，當(dāng)FF和FFA添加質(zhì)量比分別為11.2、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1和4.8、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1時(shí)，其添加的回收率分別為85.33%～98.04%和84.69%～96.82%;在鶴鶉蛋樣品中，當(dāng)FF和FFA添加質(zhì)量比分別為10.6、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1和4.6、50.0、100.0、200.0μg·kg^-1時(shí)，其添加的回收率分別為87.26%～96.95%和86.32%～96.84%。說明本試驗(yàn)運(yùn)用的ASE技術(shù)對樣品進(jìn)行前處理效果較好，所測得的樣品回收率在84.69%～98.04%，添加質(zhì)量比為LOQ水平時(shí)，回收率在84.69%～87.26%，RSD在3.7%以下，說明本試驗(yàn)所采用的方法自動(dòng)化程度高、萃取效率高、重復(fù)性好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性考察

標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性考察不僅可以節(jié)省開支，節(jié)約時(shí)間人力，大大縮減試驗(yàn)成本，同時(shí)對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性也十分重要。本試驗(yàn)對FF和FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行穩(wěn)定性考察試驗(yàn)，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在-70℃環(huán)境下避光保存3個(gè)月，4℃環(huán)境下保存1個(gè)月，或室溫下保存24h，其穩(wěn)定性均較好。

3 討論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

在已報(bào)道文獻(xiàn)中，對于氯霉素類藥物的提取多采用液一液提取的方法，使用的萃取劑多為乙腈、乙酸乙酯或兩者的混合物[16-17]。采用自動(dòng)提取設(shè)備提取基質(zhì)中的報(bào)道很少，而使用加速溶劑萃取儀同時(shí)萃取禽蛋中的FF和FFA的方法未見報(bào)道。樣品前處理效果直接關(guān)系到后續(xù)檢測結(jié)果的好壞，液-液萃取繁瑣的手動(dòng)操作增加了樣品污染和目標(biāo)物丟失等風(fēng)險(xiǎn)，而ASE提取法樣品回收率高、高效快速全自動(dòng)，重復(fù)性好，所以本試驗(yàn)采用ASE提取法減少手動(dòng)操作的誤差，提高目標(biāo)物回收率。另外，萃取劑的選擇對目標(biāo)物的提取效率的影響也很大，乙腈的去蛋白效果較好，而禽蛋中最主要的干擾物質(zhì)就是蛋白質(zhì)，為了獲得更高的提取效率，最終選擇氨水氨化的乙腈作為萃取劑。因?yàn)镕FA帶有氨基，是弱堿性化合物，根據(jù)相似相融的提取原理，對比不同比例氨水氨化的乙腈的提取效果，最終選擇2%的氨水氨化的乙腈，效果最好，所有目標(biāo)物的回收率均在90.00%以上。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成、色譜柱的類型等因素很大程度上影響目標(biāo)物的分離和峰形的好壞。在已有報(bào)道中，Wang[18]、Moretti[19]等研究中采用C₁₈色譜柱，均獲得了較高的分離度，故本試驗(yàn)選用ACQUITYUPLC?BEH C₁₈柱作分析柱。但是由于FFA中含有氨基，其屬于弱堿性物質(zhì)，在C₁₈柱上基本不保留，隨死體積一起被洗脫出來。常采取的解決辦法就是在流動(dòng)相體系中加入甲酸銨或乙酸銨。Xie等以乙睛：NaH₂PO₄溶液（0.01mol·L^-1，含0.005mol·L^-1十二烷基硫酸鈉和0.10%三乙胺，用85%H₃PO₄調(diào)pH至4.5）=32：68（V/V）為流動(dòng)相，能夠很好地分離雞蛋中甲砜霉素、FF和FFA。本試驗(yàn)在先前的研究基礎(chǔ)上，針對離子對試劑（十二烷基硫酸鈉）、緩沖體系（磷酸鹽-磷酸）、三乙胺的用量和pH進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。試驗(yàn)考察了1、3、5、10mmol·L^-1的十二烷基硫酸鈉的影響，發(fā)現(xiàn)隨其用量的增加，F(xiàn)FA出峰時(shí)間后延，3mmol·L^-1的用量即可保證FFA出峰時(shí)間在前面：比較了0、3、5、10、20mmol·L^-1的NaH₂PO₄的影響，發(fā)現(xiàn)隨其用量的增加，F(xiàn)FA出峰時(shí)間略有提前，但鹽的使用對儀器壽命有一定影響，且易造成色譜柱堵塞，在兼顧FFA出峰和維護(hù)儀器的條件下，選用5mmol·L^-1的用量;考察了不同用量（0.01%、0.03%、0.05%和0.1%）的三乙胺的影響，發(fā)現(xiàn)0.01%的用量可改善峰拖尾的現(xiàn)象，但隨其用量的增加FFA的出峰時(shí)間提前，綜合考慮最終確定三乙胺用量為0.05%;pH對于出峰時(shí)間也有一定影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FFA的響應(yīng)值隨著pH的降低逐漸增強(qiáng)、出峰時(shí)間逐漸后延，當(dāng)pH為5.4時(shí)，F(xiàn)FA的響應(yīng)值達(dá)到最高，再降低pH對其響應(yīng)值影響不大。但出峰時(shí)間太靠后會(huì)延長檢測時(shí)間，降低檢測效率，因此，最終確定pH為5.3±0.1。為使目標(biāo)物與雜質(zhì)分開，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，當(dāng)流動(dòng)相比例為64：36時(shí)，目標(biāo)物與雜質(zhì)分離效果好且峰形良好。因此綜合考慮選定流動(dòng)相條件為：NaH₂PO₄溶液（5mmol·L^-1，含3mmol·L^-1十二烷基硫酸鈉、0.05%的三乙胺，調(diào)pH為5.3±0.1）：乙腈=64：36（V/V）。此外，本試驗(yàn)采用的UPLC法具有高分離度和高速度等優(yōu)點(diǎn)，在提高柱效的同時(shí)也提高了系統(tǒng)的靈敏度，目標(biāo)物均在5min內(nèi)被檢測到，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率，符合實(shí)際生產(chǎn)中檢測應(yīng)用的要求。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

在試驗(yàn)過程中，基質(zhì)效應(yīng)只能通過各種方法降低其影響，但不可消除。本研究采用加速溶劑萃取法降低前處理過程中內(nèi)源性物質(zhì)的影響，同時(shí)優(yōu)化色譜分析條件，適當(dāng)?shù)匮娱L待測組分的保留時(shí)間，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。此外，本試驗(yàn)采用10μL的較小進(jìn)樣量和0.2mL·min^-1的較低流速，既保證靈敏度又能降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。

4 結(jié)論

本研究首次建立并優(yōu)化了超高效液相色譜一熒光檢測法檢測鴿蛋和鶴鶉蛋中FF、FFA殘留的分析方法，并將ASE法提取目標(biāo)物與之結(jié)合，優(yōu)化萃取條件和色譜條件以提高回收率及試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。在本試驗(yàn)的方法及條件下，鴿蛋及鶴鶉蛋中FF和FFA的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.7%，回收率均在85%以上。該方法快速、方便、自動(dòng)化程度高，且定量準(zhǔn)確回收率高，滿足歐盟獸藥殘留檢測的要求，對于保障消費(fèi)者健康和打破貿(mào)易壁壘具有重要的實(shí)際意義。

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（責(zé)任編輯：張梅）

收稿日期：2019-07-13初稿;2019-10-04修改稿

作者簡介：刁志祥（1996-），男，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品品質(zhì)與安全（E-mail：1178257857@qq.com）

通信作者：謝愷舟（1964-），男，博士，研究員，研究方向：畜產(chǎn)品品質(zhì)、安全與獸藥殘留檢測方法（E-mail：yzxkz168@163.com）

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-41-G23）;揚(yáng)州大學(xué)“高端人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（201801）