刺五加調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路對(duì)順鉑所致小鼠耳毒性的防護(hù)作用

胡文良 孫學(xué)威 鄭艷秋

摘要 目的：探討刺五加對(duì)順鉑所致小鼠耳毒性的防護(hù)作用及對(duì)p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號(hào)通路的調(diào)控作用。方法：將BALB/c小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只。除空白組小鼠外，其余3組小鼠均腹腔注射順鉑4 mg/kg，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組預(yù)先給予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白組給予等量生理鹽水干預(yù)，3組小鼠干預(yù)5 d后進(jìn)行指標(biāo)的檢測及評(píng)價(jià)。檢測3組小鼠聽性腦干反應(yīng)（ABR）閾值及耳蝸組織細(xì)胞凋亡情況，蛋白免疫印跡法檢測3組小鼠耳蝸組織細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與空白組比較，模型組8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組ABR閾移降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？瞻捉M、模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）分別為（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），蛋白免疫印跡法檢測顯示，空白組、模型組及實(shí)驗(yàn)組螺旋神經(jīng)節(jié)p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)分別為（0.22±0.03）、（0.93±0.02）、（0.64±0.04）;磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）相對(duì)表達(dá)分別為（0.19±0.04）、（0.84±0.05）、（0.43±0.02），與模型組比較，空白組和實(shí)驗(yàn)組AI及螺旋神經(jīng)節(jié)p-p38MAPK、p-CREB蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：刺五加可對(duì)順鉑所致小鼠耳毒性起到保護(hù)作用，其機(jī)制與調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)抑制耳蝸細(xì)胞凋亡程序的發(fā)生有關(guān)。

關(guān)鍵詞 刺五加;耳毒性;順鉑;p38MAPK信號(hào)通路;細(xì)胞凋亡

Protective Effects of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on Cisplatin-Induced Ototoxicity in Mice by Regulating p38MAPK Signaling Pathway

Hu Wenliang，Sun Xuewei，Zheng Yanqiu

Abstract Objective：To investigate the protective effect of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi on cisplatin-induced ototoxicity in mice and the regulation of p38MAPK signaling pathway.Methods：According to body mass stratification，BALB/c mice were divided into a blank group，a model group and an experimental group，with 15 mice in each group.In addition to the blank group，all the mice in the other groups were intraperitoneally injected with DDP 4 mg/kg，while the experimental group was given the same amount of saline in advance by intraabdominal injection of Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi 4 mL/kg.The indexes were detected and evaluated after 5 days of intervention in each group.The threshold of auditory brainstem response（ABR）and apoptosis of cochlear tissue cells were detected.The expression of p38MAPK signal pathway-related protein in cochlear tissue cells was detected by Western blot.Results：Compared with the blank group，the ABR threshold shift in the model group increased at 8 Hz，12 Hz and 24 Hz（P<0.05），and compared with model group，ABR threshold in the experimental group decreased（P<0.05）.The AI of spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（2.33±0.54），（19.76±0.84），（6.97±0.77），respectively.WB detection showed that the relative expression of p-p38MAPK protein in spiral ganglion cells in the blank group，the model group and the experimental group were（0.22±0.03），（0.93±0.02），（0.64±0.04），and the relative expression of p-CREB protein was（0.19±0.04），（0.84±0.05），（0.43±0.02），respectively.Compared with the model group，the expression levels of AI and p-p38MAPK，p-CREB in the spiral ganglion of the blank group and the experimental group were significantly different（P<0.05）.Conclusion：Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi has protective effect on cisplatin-induced ototoxicity in mice.Its mechanism is related to regulating the expression of p38MAPK signaling pathway and inhibiting the apoptotic process of cochlear cells.

Key Words Radix et Caulis Acanthopanacis Senticosi; Ototoxicity; Cisplatin; p38MAPK signaling pathway; Apoptosis

中圖分類號(hào)：R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.017

順鉑（Cisplatin）化學(xué)名稱為二氯二氨合鉑，是目前國內(nèi)外公認(rèn)的具有廣譜抗癌作用的一線藥物，其是以二價(jià)鉑為中心的一種重金屬絡(luò)合物，與多種抗腫瘤藥物相協(xié)同且無交叉耐藥性，廣泛用于臨床多種實(shí)體腫瘤的治療，如頭頸癌、肺癌和卵巢癌等[1-2]。然而臨床不容忽視的一個(gè)問題是順鉑耳毒性不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，可導(dǎo)致雙側(cè)耳不可逆性聽力喪失[3]，且目前相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。刺五加又名五加參，是五加科植物刺五加的根或莖，性溫、味辛、微苦、歸脾、腎、心經(jīng);主要應(yīng)用于冠心病心絞痛、腦出血、高脂血癥、眩暈癥、慢性氣管炎及圍絕經(jīng)期綜合征等多種疾病的臨床治療[4-5]。因此，嘗試采用刺五加治療順鉑所致小鼠耳毒性，并初步觀察其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)BALB/c小鼠，8周齡，體質(zhì)量20～25 g;購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（遼）2018-0008。小鼠均分籠飼養(yǎng)，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照。

1.1.2 藥物 刺五加注射液（黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z23020808）;順鉑（南京制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080177，批號(hào)：20131004）。

1.1.3 試劑與儀器 磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）抗體（美國Santa Cruz公司）等;CKX-31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司;FZ-10002電子天平，上海凡展衡器有限公司;TDZ4-WS/TDZ4WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)廠;PAC1000型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將BALB/c小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只。除空白組小鼠外，其余3組小鼠均腹腔注射順鉑4 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射5 d。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組小鼠在腹腔注射順鉑前30 min預(yù)先給予腹腔注射刺五加4 mL/kg，空白組給予等量生理鹽水干預(yù)，3組小鼠干預(yù)5 d后進(jìn)行指標(biāo)的檢測及評(píng)價(jià)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）3組小鼠聽性腦干反應(yīng)（ABR）閾值的檢測：將3組小鼠腹腔麻醉后，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行ABR閾值的檢測，刺激聲為疏密相交替的次/秒的短聲，測試強(qiáng)度從95 dB nHL開始，5 dB為1檔逐級(jí)下降進(jìn)行測試，ABR閾值判定以剛有Ⅰ波為準(zhǔn)，同一刺激頻率下給藥前后的反應(yīng)閾差值記為ABR閾移。2）3組小鼠耳蝸組織細(xì)胞凋亡情況：斷頭處死3組小鼠，暴露耳蝸，小心將蝸內(nèi)組織及蝸軸取出，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，并制備石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液37 ℃反應(yīng)30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗后浸入封閉液中，室溫封閉10 min，滴加50 μL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，37 ℃濕潤避光反應(yīng)60 min。滴加50 μL鏈霉親和素-辣根過氧化物酶工作液，37 ℃濕潤避光反應(yīng)30 min。滴加DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min。蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參照TUNEL試劑盒的操作說明，以細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色染色為凋亡細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)高倍視野下100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)為凋亡指數(shù)（AI）。3）檢測3組小鼠耳蝸組織p38MAPK通路蛋白表達(dá)情況[7]：取部分蝸內(nèi)組織，加入裂解液后冰上裂解30 min，BCA法定量后，取50 μg進(jìn)行常規(guī)蛋白免疫印跡法（WB）檢測，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析3組細(xì)胞p-p38MAPK、p-CREB表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，用χ2檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠ABR閾值的影響

與空白組比較，模型組8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移升高（P<0.05），與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組ABR閾移降低（P<0.05）。見表1。

2.2 3組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比較

空白組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象少;模型組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，凋亡現(xiàn)象明顯，實(shí)驗(yàn)組凋亡現(xiàn)象較模型組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)清晰。模型組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)AI較空白組升高，且實(shí)驗(yàn)組低于模型組（P<0.05）。見表2。

2.3 3組小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)中p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

模型組螺旋神經(jīng)節(jié)p-p38MAPK、p-CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白組升高，而實(shí)驗(yàn)組較模型組降低（P<0.05）。見表3、圖2。

3 討論

鉑類化療藥物在臨床應(yīng)用中除對(duì)腫瘤的高活性外，胃腸道毒性、神經(jīng)毒性、腎毒性、耳毒性等不良反應(yīng)也是不容忽視的問題，嚴(yán)重影響腫瘤患者的生命質(zhì)量[8]。近來臨床已采取相應(yīng)措施防控鉑類藥物的腎毒性，但對(duì)于耳毒性的防治手段則較為落后，主要是因?yàn)閷?duì)鉑類藥物耳毒性的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。因此深入探討鉑類藥物耳毒性機(jī)制對(duì)于耳毒性的防治提供依據(jù)尤為重要。

順鉑耳毒性的基本病因之一是內(nèi)耳微循環(huán)障礙造成耳蝸缺血、缺氧、自由基產(chǎn)生增多而使耳蝸內(nèi)的結(jié)構(gòu)受到損傷，刺五加注射液主要成分為刺五加總黃酮，是由刺五加的莖葉制成中藥制劑，多用于治療缺血性心腦血管疾病，其藥理作用包括擴(kuò)張血管、促進(jìn)和改善微循環(huán)、增加器官的血流量、減少組織耗氧量、清除自由基、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝和提高組織對(duì)缺氧的耐受性等[9-10]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)5 d腹腔注射順鉑后，模型組小鼠8 Hz、12 Hz、24 Hz小鼠ABR閾移明顯高于空白組，表明經(jīng)順鉑干預(yù)后小鼠出現(xiàn)明顯的聽力下降現(xiàn)象，而在實(shí)驗(yàn)組經(jīng)刺五加注射液預(yù)處理后小鼠ABR閾移顯著低于模型組。提示刺五加注射液可能通過增加耳蝸的血液循環(huán)、改善內(nèi)耳缺血缺氧狀態(tài)而減輕順鉑所致的毒性作用。研究指出，順鉑可誘導(dǎo)耳蝸NOX3表達(dá)水平的升高，促使細(xì)大量生成活性氧及發(fā)生脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而MAPK/c-Jun氨基末端激酶細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)，激活Bcl-2家族中促凋亡成員，使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)，使caspase-9和caspase-3蛋白轉(zhuǎn)錄激活后誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終造成聽力喪失[11-13]。研究表明，刺五加多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用[14-15];刺五加葉皂苷通過開放ATP敏感性鉀通道保護(hù)缺血心肌組織，降低組織損傷程度。張珊等[16]研究認(rèn)為，刺五加注射液能抑制受損心肌細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激損傷，有關(guān)有效減輕阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷，改善心功能。賈琳琳等[17]研究顯示，刺五加注射液可通過抑制谷氨酸及其受體在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中的過度表達(dá)，對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

本研究經(jīng)TUNEL檢測顯示，模型組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈棕黃色，凋亡現(xiàn)象明顯，凋亡指數(shù)明顯高于空白組，而實(shí)驗(yàn)組凋亡現(xiàn)象較模型組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)清晰，凋亡指數(shù)也較模型組明顯降低。MAPK是調(diào)控細(xì)胞多種生理病理過程的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞外信號(hào)的刺激下p38 MAPK信號(hào)通路磷酸化，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖、炎性反應(yīng)和凋亡[18]。順鉑可激活MAPK信號(hào)通路[19];劉瑞婷等[20]發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK通路的激活可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，p38 MAPK被磷酸化激活后，使效應(yīng)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子參與介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的過程。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)刺五加注射液干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組螺旋神經(jīng)節(jié)p-p38MAPK、p-CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組降低，提示其對(duì)順鉑導(dǎo)致的耳毒性的作用機(jī)制與調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)抑制耳蝸細(xì)胞凋亡程序的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，從聽力學(xué)及耳蝸組織形態(tài)學(xué)等方面，本研究初步探討了刺五加注射液拮抗順鉑耳毒性的作用，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中會(huì)增加關(guān)于刺五加注射液作用濃度及作用時(shí)間的研究，進(jìn)一步明確藥物的最佳給藥時(shí)間、濃度及方式等。

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（2019-09-05收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬工程項(xiàng)目（KJbw2013014）作者簡介：胡文良（1969.04—），男，碩士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：鼻息肉及耳聾耳鳴的治療，E-mail：13664881598@163.com