耿麗 蔡云芳

摘要 目的：通過高效液相色譜法（HPLC）對(duì)20個(gè)不同批次同一廠家的六味地黃丸進(jìn)行指紋圖譜的建立，并對(duì)其主要成分進(jìn)行分析。方法：所有20個(gè)批次的六味地黃丸均按照統(tǒng)一方法配制供試品溶液。本研究進(jìn)樣體積為2 μL;色譜柱C18限定窄徑為2.1 mm，短柱限定為100 mm，填料粒徑限定為1.7 μm，溫控箱將色譜柱的溫度限定為35 ℃。流動(dòng)相A的主要由0.01%磷酸和超純水混合而成;流動(dòng)相B的主要由乙腈和超純水混合而成，研究中所有高效液相色譜均采用梯度洗脫程序。前期對(duì)HPLC法進(jìn)行常規(guī)的方法學(xué)考察，當(dāng)所有方法學(xué)考察均可靠良好時(shí)，再對(duì)所有批次六味地黃丸進(jìn)行指紋圖譜的建立，然后做進(jìn)一步的相似度分析和主要成分分析。結(jié)果：1）六味地黃丸中主要成分梓醇、馬錢苷、山藥素Ⅰ均可見良好的分離度，最重要的是這3中成分之間并不存在任何內(nèi)源性的干擾物質(zhì)，顯示各個(gè)成分的專屬性均較好。2）對(duì)照品線性回歸分析結(jié)果顯示：梓醇對(duì)照品回歸方程：Y=4 110X+798.99;馬錢苷對(duì)照品回歸方程：Y=4 201X-6.013 4;山藥素Ⅰ回歸方程：Y=2 632X+115.38。3）梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ精密度試驗(yàn)的RSD值分別為0.32%、0.51%、0.27%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值分別為1.98%、2.13%、1.11%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD值分別為1.35%、1.16%、1.02%;加樣回收試驗(yàn)的RSD值分別為2.37%、1.54%、1.93%，均符合當(dāng)RSD值<3%時(shí)，說明采用HPLC這一測(cè)定方法是可靠的。4）建立六味地黃丸HPLC指紋圖譜后，經(jīng)過相似度計(jì)算，從S1-S20的相似度均大于0.90，說明20個(gè)批次的六味地黃丸的樣品相似度良好。5）20批不同批次的六味地黃丸中中梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20個(gè)不同批次的六味地黃丸中梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量的平均值分別為（2.176±0.290）mg/g、（1.875±0.119）mg/g、（1.776±0.095）mg/g。結(jié)論：采用HPLC建立六味地黃丸指紋圖譜，20個(gè)不同批次六味地黃丸經(jīng)過相似度良好，且各主要成分分析間未見明顯差異。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;指紋圖譜;六味地黃丸;濃縮丸;梓醇;馬錢苷;山藥素Ⅰ;主要成分分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Liuwei Dihuang Pills and Analysis of Its Main Components

Geng Li1，Cai Yunfang2

Abstract Objective：To establish the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills from 20 different batches of the same manufacturer by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze its main components.Methods：All 20 batches of Liuwei Dihuang Pills were prepared into test solutions according to an unified method.In this study，the injection volume was 2 μL，the narrow diameter of column C18 was 2.1 mm，the short column was 100 mm，the particle size of filler was 1.7 μm，and the temperature of column was 35 ℃ in temperature control box.Mobile phase A was mainly composed of 0.01% phosphoric acid and ultra-pure water，while mobile phase B was mainly composed of acetonitrile and ultra-pure water.Gradient elution procedure was used in all the high performance liquid chromatography studies.Previously，the routine methodology of HPLC was investigated.When all the methodological investigations were reliable and good，the fingerprints of all batches of Liuwei Dihuang Pills were established，and then further similarity analysis and principal component analysis were conducted.Results：1）Catalpol，loganin and batatasin I，the main components of Liuwei Dihuang Pills，showed good resolution.Most importantly，there were no endogenous interfering substances among the 3 components，which showed that the specificity of each component was good.2）Linear regression analysis showed that Catalpol regression equation：Y=4110X+798.99; loganin regression equation：Y=4201X-6.013 4; batatasin I regression equation：Y=2632X+115.38.3）RSD values of catalpol，loganin and batatasin I precision test were 0.32%，0.51% and 0.27%; RSD values of stability test were 1.98%，2.13% and 1.11%; RSD values of repeatability test were 1.35%，1.16% and 1.02%; RSD values of sample addition recovery test were 2.37%，1.54% and 1.93% respectively，which were in line with that when RSD values were less than 3%，thus the determination method of HPLC was reliable.4）After establishing the fingerprint of Liuwei Dihuang Pills by HPLC，the similarity calculated from S1-S20 was greater than 0.90，indicating that the samples of 20 batches of Liuwei Dihuang Pills had good similarity.5）The contents of catalpol，loganin and batatasin I in 20 batches of Liuwei Dihuang Pills had no significant statistical difference.The average values of catalpol，loganin and batatasin I in 20 batches of Liuwei Dihuang Pills were（2.176±0.290）mg/g，（1.875±0.119）mg/g，（1.776±0.095）mg/g，respectively.Conclusion：The fingerprint of Liuwei Dihuang Pills was established by HPLC.The similarity of 20 different batches of Liuwei Dihuang Pills was good，and there was no significant difference among the main components.

Key Words High performance liquid chromatography; Fingerprint; Liuwei Dihuang Pills; Concentrated pills; Catalpol; Loganin; Batatsin I; Main components analysis

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.011

醫(yī)家錢乙在宋代時(shí)期的著書《小兒藥證直訣》中記載了滋陰補(bǔ)腎良方——六味地黃丸，而這一僅由熟地黃、山茱萸肉、澤瀉、干山藥、白茯苓、牡丹皮組成的藥方，不僅對(duì)頭暈耳鳴有療效，對(duì)腰膝酸軟等腎陰虧虛的病癥也屢見奇效[1-2];現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)六味地黃丸在增強(qiáng)免疫力，改善腎功能等方面的功效[3-5]。而對(duì)六味地黃丸的藥物質(zhì)量控制方面，目前的研究較少，有研究者[6-7]從沒食子酸、芍藥苷等方面入手研究六味地黃丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn);然而沒食子酸是山茱萸中含有的成分之一，而芍藥苷則是牡丹皮的成分之一，均不是這2種藥物的主要成分。《中華人民共和國(guó)藥典》中明確規(guī)定了梓醇作為熟地黃的主要有效成分[8]，馬錢苷作為山茱萸的主要有效成分[9]，山藥素Ⅰ作為干山藥的主要有效成分[10]，由于在六味地黃丸中熟地黃、山茱萸肉和干山藥作為本方的君臣藥，因此本研究主要成分分析從梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ入手，并建立六味地黃丸的HPLC指紋圖譜?，F(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent安捷倫科技有限公司，型號(hào)：1200-LC）;進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent安捷倫科技有限公司，型號(hào)：G1329B）;四元泵（美國(guó)Agilent安捷倫科技有限公司，型號(hào)：G1311C）;電子版分析天平（河南兄弟儀器有限公司，型號(hào)：AS220.R2）;超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博有限公司，型號(hào)：Mili-RO Reference）;數(shù)字定時(shí)超聲波清洗器（杭州蕭山余祝超聲波設(shè)備廠，型號(hào)：ps—100A）。

1.2 試藥 梓醇對(duì)照品純度≥98%（批號(hào)：110808-258）和馬錢苷對(duì)照品純度≥98%（批號(hào)：120801）的藥品供應(yīng)方均是中國(guó)食品藥品檢定研究所;山藥素Ⅰ對(duì)照品純度≥98%（批號(hào)：51415-00-0）的藥品由南京廣潤(rùn)生物制品有限公司提供。色譜純乙腈（美國(guó)Fisher公司，批號(hào)：102489，）;色譜純甲醇（南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：23612-57-9）。

1.3 分析藥品 六味地黃丸（濃縮丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993068），隨機(jī)選取20個(gè)不同批次的六味地黃丸18070065、18070124、18070003、18070035、18070002、18070025、18070008、18070016、18070057、18070041、18070011、18070064、18070019、18070082、18070111、18070073、18070036、18070029、18070040、18070077分別標(biāo)識(shí)為S1、S2、……S20。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 進(jìn)樣體積為2 μL;色譜柱C18（色譜柱型號(hào)：安捷倫ZorbaxSB，產(chǎn)品廠家：美國(guó)Agilent安捷倫科技有限公司），本研究的C18柱限定窄徑為2.1 mm，短柱限定為100 mm，填料粒徑限定為1.7 μm，溫控箱將色譜柱的溫度限定為35 ℃。流動(dòng)相A的主要由0.01%磷酸和超純水混合而成;流動(dòng)相B的主要由乙腈和超純水混合而成，研究中所有高效液相色譜洗脫梯度程序均根據(jù)表1進(jìn)行。檢測(cè)波長(zhǎng)通過3D紫外吸收?qǐng)D譜顯示在256 nm和274 nm時(shí)可以檢測(cè)到較多的吸收峰。見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 采用電子分析天平精密分別精密稱取梓醇對(duì)照品、馬錢苷對(duì)照品和山藥素Ⅰ對(duì)照品各5.0 mg，分別放置在用標(biāo)簽標(biāo)記好3個(gè)對(duì)照品名的5 mL容量瓶中，并用色譜純甲醇定容配制成所需濃度，最終得梓醇對(duì)照品溶液每毫升含有梓醇0.25 mg;馬錢苷對(duì)照品溶液每毫升含有馬錢苷0.15 mg;山藥素Ⅰ對(duì)照品溶液每毫升含有山藥素Ⅰ0.35 mg。將3種對(duì)照品溶液混合搖勻后，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 所有批次的六味地黃丸均按照統(tǒng)一方法配制供試品溶液，具體操作如下：首先采用電子分析天平精密稱取六味地黃丸1 g，然后將六味地黃丸在研缽中搗碎成粉末狀，將六味地黃丸粉和10 mL甲醇混合如錐形瓶中密閉，并于數(shù)字定時(shí)超聲波清洗器中提取30 min，待冷卻后以甲醇補(bǔ)足失重分量，手工搖勻后又在離心機(jī)上充分混合10 min，即得六味地黃丸供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)六味地黃丸供試品溶液和梓醇對(duì)照品溶液、馬錢苷對(duì)照品溶液和山藥素Ⅰ對(duì)照品溶液進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，本研究結(jié)果顯示，六味地黃丸中主要成分梓醇、馬錢苷、山藥素Ⅰ均可見良好的分離度，最重要的是這3中成分之間并不存在任何內(nèi)源性的干擾物質(zhì)，顯示各個(gè)成分的專屬性均較好。

2.5 線性關(guān)系考察 根據(jù)對(duì)照品溶液配制方法將梓醇對(duì)照品溶液、馬錢苷對(duì)照品溶液和山藥素Ⅰ對(duì)照品溶液分別根據(jù)從高到低的梯度，配制5個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液，計(jì)算并繪制回歸方程，方程中縱坐標(biāo)Y是各對(duì)照品的峰面積，橫坐標(biāo)X是各對(duì)照品的濃度，結(jié)果顯示梓醇對(duì)照品溶液、馬錢苷對(duì)照品溶液和山藥素Ⅰ對(duì)照品溶液線性關(guān)系考察均顯示良好。見表2。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 取同一批次同一時(shí)間配制的六味地黃丸供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量并換算其各自對(duì)應(yīng)的RSD值，結(jié)果顯示這3個(gè)主要成分的RSD值分別為0.32%、0.51%、0.27%，符合當(dāng)RSD值<3%時(shí)，即說明高效液相色譜儀器的精密度良好。見表3。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇同一份六味地黃丸供試品溶液，根據(jù)靜置時(shí)間的從短到長(zhǎng)（0、2、4、8、12、24 h）依次檢測(cè)六味地黃丸中主要成分梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量并換算各成分的RSD值，結(jié)果顯示這3個(gè)主要成分的RSD值分別為1.98%、2.13%、1.11%，符合當(dāng)RSD值<3%時(shí)，即說明六味地黃丸供試品溶液在靜置24 h內(nèi)都能保持良好的穩(wěn)定性。見表4。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批次同一制備方法制備的六味地黃丸供試品溶液，使用同一臺(tái)高效液相色譜儀器重復(fù)測(cè)試該供試品溶液，檢測(cè)六味地黃丸中主要成分梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量并換算各成分的RSD值，結(jié)果顯示這3個(gè)主要成分的RSD值分別為1.35%、1.16%、1.02%，符合當(dāng)RSD值<3%時(shí)，即說明六味地黃丸供試品溶液能夠保持良好的重復(fù)性。見表5。

2.9 回收率試驗(yàn) 在含量已知的六味地黃丸供試品溶液中，加入含量相同的對(duì)照品溶液，混合均勻后，對(duì)混合液和各個(gè)對(duì)照品溶液分別重復(fù)檢測(cè)6次，檢測(cè)六味地黃丸供試品溶液中主要成分梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量并換算各成分的RSD值，結(jié)果顯示這3個(gè)主要成分的RSD值分別為2.37%、1.54%、1.93%，符合當(dāng)RSD值<3%時(shí)，即說明采用HPLC法測(cè)定六味地黃丸供試品溶液中主要成分的含量是可靠的。

2.10 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.10.1 六味地黃丸指紋圖譜的建立 以S20為參考圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》將其他批次的六味地黃丸樣品的色譜峰與S20進(jìn)行自動(dòng)匹配，獲得16個(gè)共有峰，生成六味地黃丸HPLC指紋圖譜。經(jīng)過相似度計(jì)算，從S1-S20的相似度分別是0.899、0.961、0.949、0.923、0.936、0.955、0.889、0.978、0.944、0.967、0.926、0.965、0.914、0.961、0.905、0.971、0.988、0.897，如果保留2位小數(shù)，所有的樣本均大于0.90，說明20個(gè)批次的六味地黃丸的樣品相似度良好。見圖2。

2.10.2 六味地黃丸的主要成分分析結(jié)果 20批不同批次的六味地黃丸中主要成分梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的分析結(jié)果顯示，各個(gè)批次中梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20個(gè)不同批次的六味地黃丸中梓醇、馬錢苷和山藥素Ⅰ的含量的平均值分別為（2.176±0.290）mg/g、（1.875±0.119）mg/g、（1.776±0.095）mg/g。見表5。

3 討論

目前在中藥研究的領(lǐng)域中，在研究中藥質(zhì)量控制方面和真?zhèn)舞b別方法上，指紋圖譜是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的較好的研究方法[11]。高效液相色譜法（HPLC）因其信息量豐富而在中藥指紋圖譜研究中被運(yùn)用最多最廣的方法[12-13]，有研究人員采用高效液相指紋圖譜法檢測(cè)六味地黃丸，采用聚類分析法研究發(fā)現(xiàn)不同劑型的六味地黃丸存在明顯的HPLC指紋圖譜差異[14-16];其他研究人員[17-19]進(jìn)通過系統(tǒng)指紋定量法進(jìn)一步考察不同劑型六味地黃丸的制作工藝，通過比較六味地黃丸濃縮丸、水蜜丸和膠囊等3種不同劑型，發(fā)現(xiàn)從工藝穩(wěn)定性角度分析，濃縮丸最好，膠囊次之，而水蜜丸最差;而從六味地黃丸所含化學(xué)物質(zhì)差異性角度分析，則濃縮丸最好，水蜜丸次之，而膠囊的差異性最大。盡管研究人員對(duì)不同劑型的六味地黃丸做了大量研究，但是對(duì)單一劑型的深入研究仍然不多，因此本研究針對(duì)工藝穩(wěn)定性和化學(xué)物質(zhì)差異性最好的六味地黃丸濃縮丸進(jìn)行深入研究。本研究隨機(jī)選取20個(gè)不同批次同一廠家的六味地黃丸濃縮丸進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，并將其編號(hào)S1-S20，以S20為參考圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》將其他批次的六味地黃丸樣品的色譜峰與S20進(jìn)行自動(dòng)匹配，獲得16個(gè)共有峰，將生成的六味地黃丸HPLC指紋圖譜經(jīng)過相似度計(jì)算，結(jié)果顯示所有的樣本相似度均大于0.90，說明研究中20個(gè)批次的六味地黃丸的樣品相似度良好。

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（2019-03-19收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：江蘇省預(yù)防醫(yī)學(xué)科研課題立項(xiàng)項(xiàng)目（Y2015044）作者簡(jiǎn)介：耿麗（1976.11—），女，碩士，主管中藥師，研究方向：臨床中藥學(xué)，E-mail：249843093@qq.com