丹黃通脈方對頸動脈粥樣硬化性狹窄模型大鼠炎性反應(yīng)及腦血流量的影響

李嘉民 劉海濤 馬建剛 楊春燕

摘要 目的：探究丹黃通脈方對頸動脈粥樣硬化性狹窄模型大鼠炎性反應(yīng)及腦血流量的影響。方法：將SPF級、雄性SD大鼠80只隨機分為正常組、陽性對照組、模型組和觀察組，每組20只。陽性對照組、模型組及觀察組大鼠均采用高脂加高蛋氨酸復(fù)合飼料喂養(yǎng)聯(lián)合頸總動脈球囊拉傷術(shù)法構(gòu)建頸動脈粥樣硬化性狹窄大鼠模型，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，且不進(jìn)行頸總動脈球囊拉傷術(shù)。造模成功后，陽性對照組大鼠給予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃給藥，觀察組大鼠給予丹黃通脈方20 g/kg（濃度：10 mL/kg）灌胃給藥，正常組與模型組則灌胃等量生理鹽水，2次/d，各組均連續(xù)給藥8周。干預(yù)結(jié)束后，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中血脂四項總膽固醇（TC），三酰甘油（TG），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及同型半胱氨酸（Hcy）水平;HE染色觀察大鼠頸動脈病理學(xué)形態(tài)變化;采用激光多普勒血流儀測定各組大鼠腦血流量。結(jié)果：與正常組比較，模型組和觀察組TC、TG、LDL-C水平，TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著升高，而HDL-C顯著降低;但與模型組比較，陽性對照組和觀察組TC、TG、LDL-C水平，炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著降低，而HDL-C顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與正常組比較，模型組和觀察組大鼠局部腦血流量顯著降低;與模型組比較，陽性對照組和觀察組大鼠腦血流量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：丹黃通脈方可有效降低頸動脈粥樣硬化性狹窄大鼠的血脂，具有抗炎作用，可降低炎性遞質(zhì)水平，可增加腦血流量。

關(guān)鍵詞 丹黃通脈方;頸動脈粥樣硬化性狹窄;炎性反應(yīng);腦血流量

Effects of Danhuang Tongmai Recipe on Inflammatory Reaction and Cerebral Blood Flow in Rats with Carotid Atherosclerotic Stenosis

LI Jiamin， Liu Haitao， Ma Jiangang， Yang Chunyan

Abstract Objective：To investigate the effects of Danhuang Tongmai Recipe on inflammatory response and cerebral blood flow in rats with carotid atherosclerotic stenosis. Methods：A total of 80 SPF and male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a normal group （n=20）， a positive control group （n=20）， a model group （n=20） and an experimental group （n=20）. Rats in the positive control group， the model group and the experimental group were treated with high-fat plus methionine compound feed combined with carotid artery balloon injury to construct a rat model of carotid atherosclerotic stenosis. The normal group was fed with normal feed and no ballooning of the common carotid artery was performed. After successful modeling， rats in the positive control group were given simvastatin 2.5 mg/kg by intragastric administration， and rats in the experimental group were administered with Danhuang Tongmai Recipe 20 g/kg （concentration：10 mL/kg）. The normal group and the model group were given the same amount of normal saline twice a day， and each group was continuously administered 8 weeks. After the intervention， the levels of TC， TG， LDL-C and HDL-C in the serum of the rats in each group were detected by automatic biochemical analyzer; The levels of TNF-α， IL-6， CRP and Hcy in the serum of each group were detected by ELISA; HE staining was used to observe the pathological changes of carotid artery in rats; The cerebral blood flow of each group was measured by laser Doppler flowmetry. Results：Compared with the normal group， the levels of TC， TG， LDL-C， TNF-α， IL-6， CRP and Hcy in the model group and experimental group significantly increased， while HDL-C significantly reduced; Compared with the model group， TC， TG， LDL-C levels， inflammatory factors TNF-α， IL-6， CRP and Hcy levels significantly reduced in the positive control group and the experimental group， while HDL-C significantly increased （P<0.05）; At the same time， compared with the normal group， the cerebral blood flow significantly reduced in the model group and the experimental group; Compared with the model group， the cerebral blood flow of the positive control group and the experimental group significantly increased （P<0.05）. Conclusion：Danhuang Tongmai Recipe can effectively reduce the blood lipids of rats with carotid atherosclerotic stenosis， with anti-inflammatory effects， which can reduce the level of inflammatory mediators. At the same time， it can also increase cerebral blood flow， which is worthy of clinical recommendation.0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

Key Words Danhuang Tongmai prescription; Carotid atherosclerotic stenosis; Inflammatory reaction; Cerebral blood flow

中圖分類號：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.020

近年來，頸動脈粥樣硬化性狹窄的發(fā)病率逐年升高，是缺血性血管疾病的重要致病因素。已有研究證實，頸動脈粥樣硬化是一種炎性反應(yīng)性疾病，血脂異常是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，血脂代謝紊亂可激活炎性反應(yīng)，促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈粥樣硬化性狹窄可引起不同程度的腦血流動力學(xué)障礙，是腦中風(fēng)的獨立危險因素[3]。丹黃通脈方由丹參、黃連、葛根和三七組成，具有調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)斑通脈、抗炎等功效。為此，本研究旨在探究丹黃通脈方對頸動脈粥樣硬化性狹窄模型大鼠炎性反應(yīng)及腦血流量的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF級、雄性、健康SD大鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（軍）2007-007號。

1.1.2 藥物

丹參、黃連、葛根和三七粉飲片（陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院）;高脂加高蛋氨酸飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）;辛伐他?。ǔ啥既A宇制藥有限公司，批號：090702）。丹黃通脈方由丹參、黃連、葛根和三七粉組成（質(zhì)量比為2∶1∶1∶0.2），取適量水煎煮2次，濃縮至濃度為2 g/mL，密封。

1.1.3 試劑與儀器

總膽固醇（TC），三酰甘油（TG），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及同型半胱氨酸（Hcy）酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司）等。

LEICARM2235石蠟切片機（德國Leica公司）;5417R型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;PF5001激光多普勒血流儀（瑞典PERIMED公司）;BH2生物顯微鏡（蘇州鷗斯特光學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將SPF級、雄性SD大鼠80只隨機分為正常組、陽性對照組、模型組及觀察組。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠給予高脂加高蛋氨酸復(fù)合飼料喂養(yǎng)，4周末采血檢測血清TC和Hcy值，確定升高后行頸總動脈球囊拉傷術(shù)：4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，結(jié)扎右頸外動脈遠(yuǎn)心端，阻斷右頸總動脈近心端及右頸內(nèi)動脈血流，于右頸外動脈遠(yuǎn)心端放入2.0F動脈去栓導(dǎo)管，充入0.1～0.2 mL氣體，然后勻速回拉球囊，并回抽球囊內(nèi)氣體，取出導(dǎo)管，恢復(fù)血流[4]。將建模成功的60只頸動脈粥樣硬化性狹窄大鼠隨機分為陽性對照組、模型組及觀察組，每組20只。

1.2.2 給藥方法

陽性對照組大鼠給予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃給藥，觀察組大鼠給予丹黃通脈方20 g/kg（濃度為：10 mL/kg）灌胃給藥，正常組與模型組則灌胃等量生理鹽水，2次/d，各組均連續(xù)給藥8周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中血脂水平：末次藥物干預(yù)后，各組大鼠斷尾取血，血液標(biāo)本離心，3 000 r/min，15 min，取上清液。采用全自動生化分析儀檢測大鼠血脂水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy的水平：將采集好的各組大鼠的血液標(biāo)本離心，3 000 r/min，15 min，取上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy的水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

蘇木精-伊紅（HE）染色觀察頸動脈病理學(xué)形態(tài)：末次藥物干預(yù)后，處死各組大鼠，收集頸動脈標(biāo)本。4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、切片等步驟后進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察頸動脈內(nèi)膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、管壁增厚及管腔狹窄等病理變化。

腦血流量測定：末次藥物干預(yù)后，采用4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定大鼠頭部，在額頂約1 cm處暴露顱骨，牙科鉆在左側(cè)顱骨鉆開一個顱窗（約4 mm×4 mm），剝離使露出軟腦膜。采用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流值，以灌注單位（PU）表示，記錄3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂TC，TG，LDL-C及HDL-C水平比較

與正常組比較，模型組、觀察組大鼠血脂TC、TG、LDL-C水平顯著升高，而HDL-C顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;但與模型組比較，陽性對照組和觀察組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，而HDL-C顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平比較

與正常組比較，陽性對照組、模型組和觀察組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;但與模型組比較，陽性對照組和觀察組炎性反應(yīng)因子TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

2.3 各組大鼠頸動脈病理學(xué)改變情況比較

正常組大鼠頸動脈內(nèi)膜光滑，未觀察到內(nèi)膜增生，內(nèi)皮細(xì)胞完整，平滑肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，且未見脂質(zhì)沉積。模型組頸動脈內(nèi)膜增厚，結(jié)構(gòu)不清晰，有大量炎性細(xì)胞浸潤，伴膽固醇結(jié)晶及鈣化病灶。陽性對照組和觀察組大鼠頸動脈內(nèi)膜輕度增厚，內(nèi)膜欠光滑，伴少量纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.4 各組大鼠腦血流量比較

正常組、模型組、陽性對照組及觀察組大鼠腦血流量值分別為（392.31±79.25）PU、（218.57±75.24）PU、（364.82±71.36）PU和（321.93±68.83）PU。與正常組比較，模型組和觀察組大鼠局部腦血流量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組和觀察組大鼠腦血流量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化通常表現(xiàn)為脂質(zhì)沉積，伴平滑肌細(xì)胞增殖，引起管壁增厚、管腔狹窄，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和血管炎性反應(yīng)[5]。同時，動脈粥樣硬化往往發(fā)生在頸動脈分叉處，造成頸動脈斑塊和狹窄。研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈粥樣硬化性狹窄與缺血性腦血管病密切相關(guān)[6]。近年來，中醫(yī)藥治療頸動脈粥樣硬化性狹窄疾病備受關(guān)注，也取得了較大進(jìn)展。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，頸動脈粥樣硬化性狹窄屬于熱毒血瘀證，該病位在血脈，瘀血停聚，氣血運行受阻，日久成“毒”，損傷脈絡(luò)，進(jìn)而阻痹脈管。丹黃通脈方由丹參、黃連、葛根、三七組成，丹參活血化瘀，黃連清熱解毒，兩藥配伍祛瘀血，解瘀毒，佐以葛根通利血脈，三七活血消斑，全方具有活血解毒、消斑通脈的功效。血脂代謝紊亂可造成血管內(nèi)皮功能受損，促進(jìn)炎性反應(yīng)遞質(zhì)釋放，進(jìn)而加速頸動脈粥樣硬化狹窄的發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦血管病患者血清中TNF-α與IL-6水平顯著增加[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈粥樣硬化患者血清TNF-α與IL-6水平明顯升高，且隨著疾病加重而呈上升趨勢，提示TNF-α與IL-6參與頸動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[9]。CRP是一個獨立的動脈硬化預(yù)測指標(biāo)。研究表明，CRP可能直接參與了頸動脈粥樣硬化的形成，且與頸動脈粥樣硬化有明顯相關(guān)性[10]。

Hcy可能是動脈粥樣硬化等心血管疾病的一個獨立危險因子引起關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，Hcy能加劇局部炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)頸動脈粥樣硬化發(fā)展，并與腦卒中密切相關(guān)[11]。已有研究證實，頸動脈粥樣硬化患者血清中Hcy表達(dá)顯著增加，且Hcy表達(dá)水平與頸動脈粥樣硬化程度正相關(guān)[12]，并推測Hcy與頸動脈粥樣硬化性狹窄和斑塊的形成密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，黃連和三七可有效降低血管炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，也可通過抗炎和調(diào)節(jié)血脂等作用，抑制動脈粥樣硬化發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和觀察組TC、TG、LDL-C水平，TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著升高，而HDL-C顯著降低;但與模型組比較，陽性對照組和觀察組TC、TG、LDL-C水平，炎性反應(yīng)遞質(zhì)TNF-α、IL-6、CRP及Hcy水平顯著降低，而HDL-C顯著升高，提示丹黃通脈方可有效降低頸動脈粥樣硬化性狹窄大鼠的血脂，也可降低炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平，具有抗炎作用。

腦血流量的測定是評價腦缺血損傷與修復(fù)的重要指標(biāo)，同時，頸動脈粥樣硬化性狹窄可引起不同程度的腦血流障礙。研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有增加微循環(huán)灌流量，改善腦部微循環(huán)、減輕頸動脈粥樣硬化狹窄的作用;黃連提取物也可擴張軟腦膜微循環(huán)，改善微循環(huán)障礙，維持大腦血流量;葛根可使腦內(nèi)耗氧降低，對腦缺血、缺氧具有保護(hù)作用[14];研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可明顯擴張小鼠軟腦膜微血管，增加局部血流量，保護(hù)腦組織[15]。有研究表明，丹黃通脈方可增加頸動脈粥樣硬化模型大鼠的腦血流量，具有預(yù)防因腦缺血、缺氧導(dǎo)致腦組織損傷的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和觀察組大鼠局部腦血流量顯著降低;與模型組比較，陽性對照組和觀察組大鼠腦血流量明顯升高，提示丹黃通脈方可增加腦血流量，降低腦血流障礙，保護(hù)大鼠腦組織。

綜上所述，丹黃通脈方可有效降低頸動脈粥樣硬化性狹窄大鼠的血脂，具有抗炎作用，可降低炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平，同時，還可增加腦血流量。

參考文獻(xiàn)

[1]Arao K，Yasu T，Umemoto T，et al.Effects of pitavastatin on fasting and postprandial endothelial function and blood rheology in patients with stable coronary artery disease[J].Circ J，2009，73（8）：1523-1530.

[2]Davis NE.Atherosclerosis-an inflammatory process[J].J Insur Med，2005，37（1）：72-75.

[3]Ishikawa S，Ito H，Yokoyama K，et al.Phenylephrine ameliorates cerebral cytotoxic edema and reduces cerebral infarction volume in a rat model of complete unilateral carotid artery occlusion with severe hypotension[J].Anesth Analg，2009，108（5）：1631-1637.

[4]王建輝，李磊，柳芳，等.大鼠頸總動脈粥樣硬化易損斑塊模型建立與評價[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（17）：158-162.

[5]Ishii T，Asuwa N，Masuda S，et al.The effects of a myocardial bridge on coronary atherosclerosis and ischaemia[J].J Pathol，1998，185（1）：4-9.0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

[6]徐大雄，徐世成，羅華.瑞舒伐他汀聯(lián)合普羅布考對頸動脈粥樣硬化斑塊患者血脂及CRP的影響[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，41（7）：848-850，854.

[7]韓麗蓓，吳兢，朱愛華.原發(fā)性血脂異常患者情志證素分布規(guī)律及與血脂指標(biāo)相關(guān)性研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報：中醫(yī)臨床版，2013，36（6）：20-22.

[8]劉恒方，高靈利，王建平，等.脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子-α、白介素-6與人頸動脈粥樣硬化斑塊關(guān)系的研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13（2）：151-155.

[9]Shimoda M，Kaneto H，Yoshioka H，et al.Influence of atherosclerosis-related risk factors on serum high-sensitivity C-reactive protein levels in patients with type 2 diabetes：Comparison of their influence in obese and non-obese patients[J].J Diabetes Investig，2016，7（2）：197-205.

[10]齊秀彥，楊曉茹.急性腦梗死患者同型半胱氨酸水平與動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究[J].世界中醫(yī)藥，2015，2（a01）：592-593.

[11]翟莉紅.缺血性腦卒中患者血清同型半胱氨酸水平與頸動脈粥樣硬化的相關(guān)性[J].山東醫(yī)藥，2015，16（42）：94-95.

[12]王美玲.彩色多普勒超聲對腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊的診斷價值[J].中國藥物經(jīng)濟學(xué)，2017，12（2）：144-146.

[13]廖瑞雪，劉彥慧，王媛婕，等.丹參酮ⅡA對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷腦組織IL-1β和TNF-α水平的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2014，31（11）：1002-1004.

[14]任超，王萍，閆東明，等.三七總皂苷對動脈粥樣硬化小鼠的治療作用[J].中國藥理學(xué)通報，2018，34（9）：1289-1295.

[15]王永剛，齊婧，鄭剛，等.丹黃通脈方對頸動脈粥樣硬化性狹窄模型大鼠腦血流量的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，18（10）：16-18.

（2019-09-27收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項目：河北省衛(wèi)生健康委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計劃項目（ZD20140457）作者簡介：李嘉民（1972.05—），男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病，E-mail：ssrmn2@163.com0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F