雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠干細(xì)胞增殖的影響

馬佳 呂鑫 胡家磊 單宇佳 賈莉

摘?要：目的：研究雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠干細(xì)胞增殖的影響，探討其延緩衰老的可能機(jī)制。方法：選取SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、衰老模型組、雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物組、雞胚組、營(yíng)養(yǎng)組合物組和蛋清組，分別給予相應(yīng)處理，留取大鼠肝臟、腎臟、腸和腦組織，采用免疫組化法檢測(cè)衰老大鼠各組織干細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，大鼠肝臟、腎臟、腸和腦組織干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量顯著升高。結(jié)論：雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物在一定程度上可以促進(jìn)衰老大鼠的干細(xì)胞增殖，此可能為其延緩衰老的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：衰老;雞胚;營(yíng)養(yǎng)組合物;干細(xì)胞

衰老又稱為老化，是一種復(fù)雜的自然現(xiàn)象，涉及分子、細(xì)胞、組織和器官的變化[1]。干細(xì)胞作為一類多潛能細(xì)胞，能夠在一定條件下分化成為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞等多種細(xì)胞，為修復(fù)機(jī)體組織器官的損傷發(fā)揮重要作用[2]。然而，干細(xì)胞和其他成體細(xì)胞一樣，隨著年齡的增長(zhǎng)，其自我更新能力和分化能力會(huì)逐漸衰退，甚至出現(xiàn)功能性障礙[3]。研究表明，干細(xì)胞衰老會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織器官再生能力下降、體細(xì)胞數(shù)量減少，加速機(jī)體衰老[4]。因此，探索延緩干細(xì)胞衰老的治療措施是防止機(jī)體衰老的重要途徑。本研究采用D-半乳糖的方法建立衰老大鼠模型，探討雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠各器官干細(xì)胞增殖的影響，為雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物在抗衰老的臨床治療應(yīng)用上提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

營(yíng)養(yǎng)組合物由大連金斧公司提供，由賴氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸、?；撬帷⒑塑账?、維生素C、維生素D、維生素B12、葉酸、鈣、鐵、鋅、硒等52種物質(zhì)組成，按原方比率配方，經(jīng)水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用。

1.2?實(shí)驗(yàn)試劑

主要試劑：D-半乳糖（美國(guó)Sigma公司）兔抗大鼠CD90、CK19 抗體;兔抗大鼠CD133、OCT4抗體;兔抗大鼠Lgr5、Musashi-1抗體;兔抗大鼠Nestin、CD133抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）;羊抗兔二抗及SP免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)流程

選取90只SD雄性大鼠，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。根據(jù)動(dòng)物藥理學(xué)的藥品劑量和綜合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)分析，分為：（1）正常對(duì)照組;（2）衰老模型組;（3）雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物組，以雞胚（用量同雞胚對(duì)照組）和營(yíng)養(yǎng)組合物混合物進(jìn)行灌胃;（4）雞胚組，選取第3天胚齡的雞蛋，每個(gè)雞蛋取3mL雞胚液，以1mL雞胚液對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃;（5）營(yíng)養(yǎng)組合物組，1～15d以0.381 6g/d 對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，16～30d以0.763 2g/d 對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，30～90d以1.144 8g/d 對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃;（6）蛋清組，選取未受精的雞蛋，每個(gè)雞蛋取3mL蛋清，以1mL蛋清液對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃（由于雞胚組、營(yíng)養(yǎng)組合物組皆含有氨基酸類，因此特設(shè)蛋清組）。

實(shí)驗(yàn)流程：除正常對(duì)照組外，其余各組每日頸背部皮下注射D-半乳糖500mg/kg，連續(xù)造模90d。同時(shí)，從建模第1天起，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物組、雞胚組、營(yíng)養(yǎng)組合物組、蛋清組，分別以相應(yīng)劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，每天1次，直至第90天，頸椎脫臼處死大鼠，留取大鼠肝臟、腎臟、腸、腦組織標(biāo)本進(jìn)行后期檢測(cè)。

1.4?實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠部分肝臟、腎臟、腸、腦組織置于10%甲醛中固定，依次經(jīng)過(guò)常規(guī)脫水、石蠟浸泡包埋、切片后進(jìn)行組織化學(xué)染色。組織化學(xué)染色具體步驟：室溫脫蠟，將玻片置于二甲苯中2次，10min/次;水化，將玻片依次置于100%、95%、85%、75%乙醇，3min/次;水沖10min，PBS洗片2～3次，3min/次;抗原修復(fù)，溫度控制在92～95℃，玻片置于枸櫞酸鈉溶液中15min，最后自然冷卻至室溫;PBS洗片2～3次，3min/次;在玻片上滴加H2O2，避光靜置10min;PBS洗2～3次，3min/次;滴加山羊血清封閉液，室溫15min;滴加一抗50μL，4℃過(guò)夜;復(fù)溫45min，PBS洗2～3次，3min/次;滴加二抗40～50μL，室溫靜置15min;PBS洗2～3次，3min/次;滴加鏈霉卵白素-過(guò)氧化物酶40～50μL，室溫靜置15min;PBS洗2～3次，3min/次;DAB顯色5min，自來(lái)水沖洗10min，蘇木素染色30s，水沖10min;脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值用均數(shù)±SD表示。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果與分析

2.1?雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠肝臟干細(xì)胞的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組大鼠肝臟干細(xì)胞CK19的表達(dá)量顯著減少（圖1），雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，大鼠肝臟干細(xì)胞CK19的表達(dá)量顯著增加;與衰老模型組相比，雞胚組大鼠肝臟干細(xì)胞CK19的表達(dá)量明顯增加，而營(yíng)養(yǎng)組合物組和蛋清組大鼠肝臟干細(xì)胞CK19的表達(dá)量無(wú)明顯變化。各組大鼠肝臟干細(xì)胞CD90的表達(dá)量無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠肝臟干細(xì)胞的增殖有一定作用。

2.2?雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠腎臟干細(xì)胞的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組大鼠腎臟干細(xì)胞CD133、OCT4的表達(dá)量顯著降低（圖2），雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，大鼠腎臟干細(xì)胞CD133、OCT4的表達(dá)量明顯增高;與衰老模型組相比，雞胚組和營(yíng)養(yǎng)組合物組大鼠腎臟干細(xì)胞CD133、OCT4的表達(dá)量增高，但其表達(dá)量低于雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物組，而蛋清組大鼠CD133、OCT4的表達(dá)量無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物能夠顯著促進(jìn)衰老大鼠腎臟干細(xì)胞的增殖。

2.3?雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠腸道干細(xì)胞的影響01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組大鼠腸道干細(xì)胞Musashi-1、Lgr5的表達(dá)量顯著降低（圖3），雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，大鼠腸道干細(xì)胞Musashi-1、Lgr5的表達(dá)量明顯增高;與衰老模型組相比，雞胚組和營(yíng)養(yǎng)組合物組大鼠腸道干細(xì)胞Musashi-1、Lgr5的表達(dá)量增高，而蛋清組大鼠腸道干細(xì)胞Musashi-1、Lgr5的表達(dá)量無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物能夠顯著促進(jìn)衰老大鼠腸道黏膜干細(xì)胞的增殖。

2.4?雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)衰老大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響

與正常對(duì)照組相比，衰老模型組大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Nestin、CD133的表達(dá)量明顯減少（圖4），雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Nestin、CD133的表達(dá)量明顯增高;與衰老模型組相比，雞胚組和營(yíng)養(yǎng)組合物組大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Nestin、CD133的表達(dá)量增高，但其表達(dá)量低于雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物組，而蛋清組大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Nestin、CD133的表達(dá)量無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物能夠顯著促進(jìn)衰老大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

3?討論

目前研究認(rèn)為，機(jī)體衰老和干細(xì)胞衰老的發(fā)生是相互關(guān)聯(lián)的，如臨床所見(jiàn)組織器官退行性病變、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復(fù)感染等衰老現(xiàn)象，均是機(jī)體干細(xì)胞增殖能力降低和功能衰退的反映[5]。而干細(xì)胞衰老學(xué)說(shuō)是目前闡明機(jī)體衰老最新的學(xué)說(shuō)。研究表明，營(yíng)養(yǎng)組合物包含多種氨基酸、維生素、核苷酸等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠有效改善骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)小鼠造血干細(xì)胞增殖、分化[6]。雞胚蛋作為民間藥膳餐補(bǔ)食品，被學(xué)者廣泛驗(yàn)證具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力以及補(bǔ)血養(yǎng)血的功能[7]。因此，探討雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖能力對(duì)于延緩衰老、預(yù)防老年性疾病方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

CK19作為一種低分子角蛋白，其特異性表達(dá)于肝卵圓細(xì)胞表面，而卵圓細(xì)胞是目前公認(rèn)的肝臟組織來(lái)源的干細(xì)胞，在肝細(xì)胞再生能力不足的情況下，特異性分化成肝細(xì)胞[8]。CD133和OCT4作為腎臟干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，對(duì)維持干細(xì)胞的多能性以及修復(fù)腎小管損傷方面具有重要作用[9]。腸道干細(xì)胞是一類未分化的原始細(xì)胞，位于腸道隱窩的基底部，具有自我復(fù)制及分化的潛能[10]。Musashi-1和Lgr5是小腸干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)記物，對(duì)維持小腸的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[11]。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞[12]。Nestin和CD133作為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，能夠促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)重構(gòu)，修復(fù)神經(jīng)損傷[13]。本實(shí)驗(yàn)顯示，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物能夠促進(jìn)衰老大鼠肝臟干細(xì)胞、腎臟干細(xì)胞、腸粘膜干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

綜上所述，雞胚營(yíng)養(yǎng)組合物可以有效提高衰老大鼠干細(xì)胞增殖能力，為其應(yīng)用于臨床延緩衰老的治療提供科學(xué)依據(jù)。

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Effects of Chick Embryo and Nutrient Mixture on Proliferation of Stem Cells in Aging Rats01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1

MA Jia?*，LV Xin?*，HU Jia-lei，SHAN Yu-jia，JIA Li

（College of Laboratory Medicine，Dalian Medical University，Dalian 116044，China）

Abstract：Objective To study the effect of the chick embryo and nutrient mixture on the proliferation of stem cells in aging rats，and explore the mechanism of chick embryo and nutrient mixture in the treatment of aging rats.Method SD rats were randomly divided into six groups including control group，aging model group，chick embryo and nutrient mixture group，chick embryo group，nutrient mixture group and albumen group.After the corresponding treatment，immunohistochemistry staining was used to analyze the expression of liver，kidney，intestine and brain stem cell markers.Result After the aging rats treated with the combination of chick embryo and nutrient mixture，the expression of liver，kidney，stomach，intestine and brain stem cell markers were increased.Conclusion The combination of chick embryo and nutrient mixture promoted stem cells proliferation in aging rats.This might be a mechanism for the treatment of aging.

Keywords：aging;chick embryo;nutrient mixture;stem cell

（責(zé)任編輯?李婷婷）01206134-BC5A-4F8F-A342-CD06BA258BD1