楊海峰 惠林沖 潘美紅 陳微 何林玉 王江英 繆美華 陳振泰

摘要：對母系遺傳洋蔥葉片黃色條紋突變體材料進行田間表型特征觀察，葉綠素含量測定和顯微結(jié)構(gòu)觀察，并利用jnurf13分子標記鑒定保持株。結(jié)果表明，洋蔥突變體為亮綠黃色條紋。黃皮、白皮和紫皮洋蔥中均發(fā)現(xiàn)黃色條紋突變株，黃化程度越高植株長勢越弱;整個生育期黃色條紋一直存在于管狀葉、花薹、花苞、傘狀花序中花梗、花瓣、雌蕊、雄蕊等部位，直至植株枯萎也不返綠。單株自交或開放式自然授粉F1中出現(xiàn)全黃株、黃綠條紋株和綠株3種類型，無固定分離比，全黃株苗期死亡。洋蔥黃色條紋突變體黃色組織的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量顯著低于綠色組織：石蠟切片觀察結(jié)果顯示黃色和綠色組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)無差異，但綠色組織的葉綠體總數(shù)高于黃色組織;通過超顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，黃色條紋突變體綠色組織中葉綠體結(jié)構(gòu)與正常株無差異，而黃色組織中類囊體、基粒等結(jié)構(gòu)降解，嗜餓顆粒數(shù)量多且集中，影響光合作用。另外，利用jnurf13分子標記從12株可育突變體中篩選出5株保持株，可作為形態(tài)學(xué)標記用于洋蔥細胞質(zhì)雄性雜交制種。

關(guān)鍵詞：洋蔥：黃色條紋：突變體

中圖分類號：s633.2 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0157-09

條紋葉片是高等植物常見的葉色突變之一，主要有白、黃2種顏色條紋，可通過自然突變、物理輻射、化學(xué)誘變和組織培養(yǎng)等途徑產(chǎn)生。目前，在水稻、小麥、玉米、文心蘭（Oncidiumspp.）、綠槽龜甲竹[Phyllostachys edulis（Carr.）等植物中發(fā)現(xiàn)條紋突變。不同植物或同一植物條紋突變的遺傳規(guī)律存在差異，例如水稻、大麥、狼尾草突變是核基因突變，小麥葉綠素缺失突變體（Mtl35）是一個由核質(zhì)基因共同作用的突變材料，玉米（NCS6）和狼尾草（vi/vi）均是母系遺傳突變類型。條紋突變體后代出現(xiàn)全黃（白）色、綠色和黃（白）綠色條紋3種顏色葉片類型。黃（白）色條紋突變體主要是缺乏葉綠素，影響植物的光合作用及其生長，其葉綠體被膜、基質(zhì)和類囊體基本結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生變化。條紋突變體是研究植物光合作用機理和葉綠素生物合成與降解途徑，挖掘相關(guān)光合基因的重要材料。

Tatebe首先在大蔥中發(fā)現(xiàn)黃色條紋葉突變材料，通過遺傳規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)黃色條紋屬于母系遺傳，之后又在洋蔥中發(fā)現(xiàn)黃色條紋突變材料，正反雜交遺傳分析結(jié)果表明此突變亦屬于母系遺傳。洋蔥突變材料自交一代在苗期表現(xiàn)綠色和全黃，全黃苗由于缺乏葉綠素，光合能力弱，營養(yǎng)消耗完后枯死，而綠色苗在生長后期，葉片表現(xiàn)全綠色和黃色條紋2種類型。以黃色條紋葉洋蔥為父本與正常葉片洋蔥為母本進行雜交后，F(xiàn)1及其自交F2均表現(xiàn)為全綠葉片;黃色條紋材料為母本與正常洋蔥雜交F1表現(xiàn)出3種類型：全黃植株（苗期）、黃色條紋和全綠植株，其自交F2均與母株特征一致。

洋蔥條紋突變體屬母系遺傳，可作為洋蔥種質(zhì)資源材料的可視化形態(tài)學(xué)標記，在洋蔥雜交育種中具有重要意義，尤其是洋蔥保持系的鑒定。Kim報道在洋蔥育性Ms位點緊密連鎖處，發(fā)現(xiàn)含有12bp的插入序列，并開發(fā)了一種簡單PCR，用于鑒定基因型MsMs、Msms、msms，該鑒定方法能夠在含有Ms的位點中擴增出241 bp條帶，在含有瑚的位點中擴增出229 bp條帶，而在含有Msms的位點中擴增出2條帶，從洋蔥突變體可育株中通過分子標記鑒定保持株，將形態(tài)學(xué)標記與分子標記結(jié)合用于洋蔥雜交育種。本研究自2013年開始從田間收集洋蔥黃色條紋突變材料，擬對洋蔥突變體形態(tài)特征、超顯微結(jié)構(gòu)及其保持株篩選進行初步研究，為研究洋蔥光合作用機制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結(jié)構(gòu)功能和遺傳發(fā)育及調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

洋蔥試驗材料的生態(tài)類型為中日照，全部來自連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究室。2014-2017年在洋蔥資源圃中通過田間觀察篩選出12份突變株材料，名稱和特點見表1。

分別測定洋蔥突變材料綠葉組織和黃葉組織葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)綠葉組織葉綠素含量是黃葉組織的3倍，綠葉組織葉綠素a和葉綠色b含量也是黃葉組織的3倍，黃葉與綠葉組織的葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量均存在顯著差異，說明洋蔥黃綠葉組織的葉色差異可能是由于葉片組織中葉綠素含量不同所致。但是葉綠素a/b值差異不顯著（表3）。

2.2洋蔥黃色條紋突變體葉片顯微及超顯微解剖結(jié)構(gòu)

正常洋蔥綠色葉片、黃色條紋突變體黃色條紋葉片和全黃葉片的表皮、柵欄組織、海綿組織和維管束等基本結(jié)構(gòu)沒有顯著差異（圖4）。局部放大觀察，洋蔥綠葉組織部分染色較深，尤其是在柵欄組織中可見明顯的濃綠色條帶，說明綠葉組織中含有較多的葉綠體及色素（圖4-B），而黃葉組織部分染色較淺，柵欄組織中葉綠體與色素含量較少（圖4-F）。黃色條紋葉片組織具有明顯的分界線（圖4-D），綠色區(qū)域葉綠體含量明顯比黃色區(qū)域多。所以，黃色條紋突變體黃綠葉片葉色差異可能是由葉片組織中葉綠體數(shù)量及色素含量不同所致。

用透射電鏡對洋蔥黃色條紋突變體黃色區(qū)域、綠色區(qū)域及正常植株葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行比較觀察，結(jié)果表明黃色條紋突變體中綠色葉片組織的葉綠體結(jié)構(gòu)與正常植株相似，但黃色葉片組織的葉綠體結(jié)構(gòu)與正常植株存在顯著差異。正常植株葉綠體呈紡錘形，緊貼細胞壁（圖5一G），基粒片層排列有序且結(jié)構(gòu)清晰，嗜餓顆粒分散且數(shù)量較少（圖5-H、I）。黃色條紋突變體綠色葉片組織內(nèi)葉綠體呈橢圓形或紡錘形，大小不一，排列松散（圖5-D、E），類囊體和基粒片層分布均勻，嗜餓顆粒分散，但數(shù)量較多（圖5-F）;黃色條紋突變體黃色葉片組織大部分葉綠體為近橢圓形（圖5-A），基粒片層數(shù)目和基粒片層垛疊層數(shù)明顯減少，排列疏松，看不到基粒結(jié)構(gòu)和類囊體，相對于正常植株葉片組織而言，其葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)嗜餓顆粒較多且相對集中（圖5-B、c），說明洋蔥黃色條紋突變體中黃色葉片組織中葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不完整，存在明顯的缺陷。

不同植物條紋突變出現(xiàn)的時期及是否返綠各不相同。大麥（whsl8）在拔節(jié)期開始出現(xiàn)白條紋，3個月后逐漸形成正常的綠色葉。水稻（stlO）突變的葉片在2～3張葉片階段呈白色條紋，然后隨著植株的生長，白色逐漸減弱，葉片顏色恢復(fù)正常，葉脈繼續(xù)呈白色，受溫度變化的影響。水稻突變體（wsl4）在早期葉片發(fā)育過程中形成白條紋，受低溫誘導(dǎo)表達。水稻突變體（sdl）幼苗的條紋葉片對溫度高度敏感，隨著溫度的升高葉綠素含量增加。同樣安吉白茶在白葉期葉色為白色，隨后葉片轉(zhuǎn)為正常綠色。玉米（NCS6）條紋突變體在幼苗階段呈淡綠色，成熟時從葉鞘到節(jié)間呈黃色和白色。水稻wp（t）突變體在其基部葉片上呈白色條紋，而花序和花梗呈乳白色。本研究中洋蔥黃色條紋突變體在苗期和開花期的花薹、花苞、花序、雄蕊、雌蕊均為黃色，直至枯萎也不返綠。

葉色突變體中葉綠素a和葉綠素b含量減少，但大多數(shù)黃化突變體葉綠素a/b比值顯著升高，即葉綠素b降低程度大于葉綠素a[39]。本研究中洋蔥突變體葉中綠色組織葉綠素a和葉綠素b含量均高于黃色組織，而葉綠素a/b值兩者差異不顯著。su-jatha等在狼尾草黃色條紋突變體中也發(fā)現(xiàn)綠素a/b比值與對照差異不顯著。小麥條紋株葉片呈綠白相間的條紋，能夠正常成穗結(jié)實，但其株高、穗長、單株粒數(shù)、單株籽粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量都顯著低于原始親本，生育期比原始親本延長5～7d，綠株與原始親本沒有顯著差異。Zhao等。也發(fā)現(xiàn)水稻白色條紋株變矮，每穗粒數(shù)、粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀均低于對照。本研究中洋蔥黃色條紋程度越高，對光合作用影響越大，植株越矮小，對生長有一定的負面影響。

葉片條紋突變對葉片結(jié)構(gòu)有一定影響。賈學(xué)靜等研究金心吊蘭的葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)園藝栽培變種金心吊蘭的葉片更厚，葉細胞更大，不同于全綠葉片的原變種寬葉吊蘭。常青山等發(fā)現(xiàn)菊花黃綠葉突變體綠色組織和黃色組織均含有正常的組織結(jié)構(gòu)，葉色差異可能在于葉片組織中的葉綠體數(shù)量及相關(guān)色素含量不同。洋蔥條紋突變體中綠色組織和黃色組織與正常葉片組織顯微結(jié)構(gòu)無差異，均含有表皮、柵欄組織、海綿組織和維管束，黃色組織的葉綠素含量比綠色組織低。IJi等對銀杏黃綠葉突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)正常葉色區(qū)域葉綠體結(jié)構(gòu)正常，含有類囊體膜和基質(zhì)層以及少量淀粉顆粒和嗜餓顆粒，而黃色區(qū)域中葉綠體形態(tài)異常，類囊體膜破裂，基質(zhì)片層不清晰或缺失，含不規(guī)則排列的囊泡，并充滿大量嗜餓顆粒，且細胞的平均葉綠體數(shù)量和大小顯著低于正常葉片，類囊體膜系統(tǒng)明顯紊亂。王彩霞等發(fā)現(xiàn)文心蘭黃色條紋葉突變體的黃色細胞組織葉綠體發(fā)育異常，多為球形，大小不一，基質(zhì)中含較多嗜餓顆粒和囊泡，基粒片層稀疏，結(jié)構(gòu)松散，少數(shù)葉綠體的基粒片層結(jié)構(gòu)缺失。本研究中，洋蔥突變體的黃色組織葉綠體減少，近橢圓形，基粒片層結(jié)構(gòu)減少且松散或缺失，基質(zhì)中含較多嗜餓顆粒但無囊泡，綠色組織與正常植株比較，嗜餓顆粒數(shù)量多且分散，其他無差異。說明黃色條紋突變體中黃色組織葉綠體的發(fā)育受到了嚴重影響。

葉色變異作為標記性狀用于雜交育種和良種繁育，不但可以測定種子純度，還可在苗期剔除假雜種。劉國民等培育的攜帶葉色標記的黃標1A、黃標2A、黃標3A水稻不育系同正常葉色不育系Ⅱ-32A、G46A的葉色差異顯著，易肉眼識別，在秧苗生長期間便可以根據(jù)葉色差異剔除混雜的不育系或保持系，達到去雜保純的目的。洋蔥黃色條紋突變體屬于母系遺傳，洋蔥雜交制種中保持系常規(guī)選育周期長且無法肉眼識別，結(jié)合分子標記能夠在黃色條紋突變體中找到保持株。本研究中通過inurfl3分子標記從12株可育的黃色條紋突變體中，篩選出5株保持系，自交后代成苗株有黃色條紋和全綠類型，能夠直接肉眼識別，保證純度，其與不育系雜交的后代全為正常綠色的不育系。有研究者報道君子蘭（cmvv）條紋突變體中完全綠色植株也能夠再生出黃色、綠色和黃綠條紋3種不同類型。Tatebe以洋蔥、大蔥條紋突變體為母本，綠色植株為父本的雜交F1有3種類型，其中全綠株自交F2均為全綠株，所以洋蔥黃色條紋突變體可以作為一種形態(tài)學(xué)標記在育種中應(yīng)用。后續(xù)研究中會對突變體的葉綠體、線粒體DNA基因組及相關(guān)轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，研究突變原因。