姚笛，徐磊，佐兆杭，侯婷婷，郭瑜

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

0 引言

牛乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，同時(shí)易遭受致病菌污染[1]。沙門氏菌屬（Salmonella）[2]可污染食品，引發(fā)食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中位列榜首[3-6]。因此，建立一種快速的沙門氏菌檢測(cè)方法尤為重要。目前，沙門氏菌檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、免疫法和PCR方法等[7，8]，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的沙門氏菌檢測(cè)方法為微生物培養(yǎng)法，該方法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、特異性和靈敏度低等缺點(diǎn)[9-11]，免疫學(xué)方法由于非特異性吸附易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而PCR方法不能對(duì)樣品進(jìn)行定量分析[12-13]。invA是沙門氏菌的保守基因，有研究利用PCR方法對(duì)動(dòng)物性食品的invA基因進(jìn)行了特異性擴(kuò)增[14-17]。因此，本研究建立一種牛乳中沙門氏菌invA基因的熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，為牛乳中致病菌的快速檢測(cè)提供方法學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株

沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌等菌種為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；載體PMD-18 T載體。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基，TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL），rTaq（5 U/μL），MgCl2（25 mmol/L），dNTPs（10 mmol/L），DL2000DNAMarker，6×Loading Buffer，SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）等；細(xì)菌基因組DNA和質(zhì)粒抽提等試劑盒。

1.1.3 主要儀器

PCR基因擴(kuò)增儀（9700型），凝膠成像系統(tǒng)（YJ600+型），Real-Time PCR儀（Line-Gene K型），臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16B）。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和DNA模板的制備

將沙門氏菌菌種接種于LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為180 r/min，37℃培養(yǎng)12 h。離心獲得菌體后提取菌體DNA，具體操作按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.2 引物的合成

根據(jù)GenBank中的沙門氏菌的invA基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)符合熒光定量PCR擴(kuò)增要求的特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為190 bp。引物序列如下：

上游引物為5'-CGCTCTTTCGTCTGGCATT-3'；

下游引物為5'-GACCACGGTGACAATAGAG-3'。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增和克隆

利用沙門氏菌的invA基因特異性引物，以提取的菌體DNA為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增后的目的片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，具體操作見說明書。擴(kuò)增和純化后的目的片段經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。然后將純化后的目的基因與p MD-18 T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，具體操作按照說明書進(jìn)行，獲得目標(biāo)基因的克隆載體pMD-18 T-invA，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定重組質(zhì)粒濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增[18]。定量PCR的反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Tap（2X）（Tli RNaseH Plus）12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 10.5μL。反應(yīng)條件為94℃（30 s）滅活酶，95℃（5 s）變性，60℃（20 s）退火、延伸，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 特異性檢測(cè)

利用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，以invA基因的上、下游引物分別對(duì)沙門氏菌及其他3種牛乳中常見致病菌（大腸桿菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌）同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步確定建立的沙門氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.2.6 靈敏性檢測(cè)

對(duì)確定濃度的沙門氏菌DNA進(jìn)行10倍系列稀釋，以不同濃度的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定其靈敏性。

1.2.7 模擬標(biāo)本的檢測(cè)

對(duì)沙門氏菌菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，測(cè)定菌落總數(shù)，牛乳滅菌后摻入一定數(shù)量的沙門氏菌，分別為4.42×104，4.42×103，4.42×102，44.2 mL-1；混勻后提取牛乳的基因組DNA，然后相同條件下以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌invA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果與序列分析

沙門氏菌invA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果如圖2所示。由圖1和圖2可以看出，片段大小對(duì)應(yīng)Marker 200 bp處，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符合。重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與沙門氏菌invA基因的同源性為100%。圖中，M為DL2000 DNA Marker；1為沙門氏菌invA基因重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 invA基因的PCR擴(kuò)增

圖2 invA基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果

2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

測(cè)定沙門氏菌invA基因重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為56.9 ng/uL，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，濃度分別為1×105，1×106，1×107，1×108，1×109拷貝數(shù)/μL，以稀釋的不同濃度質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增曲線，如圖3所示。

依據(jù)上述質(zhì)粒模板的擴(kuò)增曲線，以不同拷貝的質(zhì)粒模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.334x+38.15，R2為0.9883，當(dāng)質(zhì)粒濃度在105～109拷貝數(shù)/μL時(shí)，質(zhì)粒濃度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的線性關(guān)系較好。

不同濃度質(zhì)粒模板的擴(kuò)增熔解曲線如圖5所示。由圖5可以看出，不同濃度質(zhì)粒模板的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度均為84.7℃。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 標(biāo)準(zhǔn)模板的qRT-PCR熔解曲線

2.3 熒光定量PCR的特異性檢測(cè)

以invA基因的上下游引物對(duì)沙門氏菌等4種牛乳中常見致病菌模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，只獲得一條沙門氏菌的擴(kuò)增曲線，其他3種致病菌未見特異性擴(kuò)增，即無交叉反應(yīng)現(xiàn)象，因此，建立的沙門氏菌的熒光定量PCR方法的特異性較好。

圖6 qRT-PCR特異性檢測(cè)

2.4 熒光定量PCR的靈敏性檢測(cè)

將沙門氏菌DNA分別稀釋成質(zhì)量濃度為1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7ng/μL；以不同質(zhì)量濃度的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線如圖7所示。由圖7可以看出：其最低檢出限為1×10-7ng/μL，即當(dāng)DNA質(zhì)量濃度只有1×10-7ng/μL時(shí)，根據(jù)公式拷貝數(shù)/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)計(jì)算出拷貝數(shù)為32.44拷貝數(shù)/μL時(shí)仍然能夠檢測(cè)到，說明建立的沙門氏菌qRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏性較好。

圖7 沙門氏菌的qRT-PCR靈敏性檢測(cè)

2.5 摻菌乳樣的檢測(cè)

在滅菌的牛乳中摻入不同菌落總數(shù)的沙門氏菌，使牛乳中菌的含量分別為4.42×104，4.42×103，4.42×102，44.2 mL-1；利用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 模擬標(biāo)本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

由圖8可以看出：當(dāng)乳中沙門氏菌的含量只有44.2 mL-1時(shí)，仍可獲得擴(kuò)增曲線，同時(shí)根據(jù)國(guó)標(biāo)方法（GB 4789.4-2016）檢測(cè)摻有相同菌落數(shù)的沙門氏菌，僅能夠檢測(cè)到4.42×102mL-1，說明建立的檢測(cè)方法的靈敏性好于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

有關(guān)牛乳的細(xì)菌污染一直是重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目，特別是對(duì)腸道致病菌沙門氏菌的檢測(cè)[19]。沙門氏菌是一種常見的重要人畜共患病原菌，它不僅能導(dǎo)致雞白痢、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等動(dòng)物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、敗血癥、食物中毒和胃腸炎。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病多例占首位[20]。沙門氏菌作為致病菌檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均有重要意義。但沙門氏菌有3 000個(gè)以上的血清型及復(fù)雜的各類生化反應(yīng)型，使常規(guī)檢驗(yàn)程序復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，不僅給檢驗(yàn)部門帶來沉重的負(fù)擔(dān)，而且還使生產(chǎn)部門產(chǎn)品運(yùn)輸和倉(cāng)儲(chǔ)的時(shí)間延長(zhǎng)，費(fèi)用增加[21-22]。因此靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法是發(fā)展的方向。

以沙門氏菌侵襲蛋白基因invA作為擴(kuò)增目標(biāo)，該基因在幾乎所有血清型沙門氏菌中高度保守，Upadhyay利用PCR方法擴(kuò)增了19種不同沙門氏菌血清型的invA基因中284bp片段，均獲得特異性擴(kuò)增[23]。因此，本研究選擇特異性序列進(jìn)行引物合成，結(jié)合熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)要求，選擇了擴(kuò)增片段大小為149 bp的invA引物，結(jié)果表明該引物具有良好的特異性。通過試驗(yàn)不斷篩選合適的引物濃度、PCR反應(yīng)體系、退火溫度等條件，可以保證PCR的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。熒光定量PCR檢測(cè)沙門氏菌的全部操作過程需要4 h左右，不僅大大提高了工作效率，并且除去需加樣的步驟外，其他的全部過程都在密閉的PCR管中完成，可以有效的避免由外界環(huán)境帶來的誤差。具有的快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性好等特點(diǎn)?？赏酵瓿稍S多個(gè)樣品的同時(shí)擴(kuò)增及定量，適宜于大批樣品的檢測(cè)處理，極大地提高了檢測(cè)時(shí)限，為食品污染的監(jiān)測(cè)和食物中毒事件的快速反應(yīng)提供了技術(shù)支持。盡管實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)設(shè)備較昂貴，但由于其能對(duì)樣品中細(xì)菌污染進(jìn)行定量，且靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，更易于自動(dòng)化，必然會(huì)成為細(xì)菌檢測(cè)的常規(guī)手段。