順鉑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞損傷及二仙湯含藥血清保護(hù)顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制

楊蕾 饒晨晨 孫麗萍

摘要 目的：探討順鉑對卵巢顆粒細(xì)胞的影響及二仙湯含藥血清改善大鼠卵巢顆粒細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。方法：選取大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及順鉑處理的方法，將順鉑處理后卵巢顆粒細(xì)胞隨機(jī)分為：cDDP組、cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組，另設(shè)正常組，加入相應(yīng)藥理血清連續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Western Blotting法檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞bcl-2、bax蛋白表達(dá);RT-PCR法檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞bcl-2、bax mRNA表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組比較，cDDP組bax mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與cDDP組比較，CDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組Bax mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常組比較，cDDP組bcl-2 mRNA水平及蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與cDDP組比較，CDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：二仙湯能夠抑制cDDP誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)bcl-2/bax平衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 二仙湯;順鉑;含藥血清;卵巢顆粒細(xì)胞;卵巢功能低下;不孕;B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白家族

Abstract Objective：To explore the effects of cisplatin on ovarian granulosa cells and the mechanism of Erxian decoction containing serum improving the damage of ovarian granulosa cells in rats.Methods：The cisplatin-treated cells by in vitro culture and cisplatin treatment of rat primary ovarian granulosa cells were randomly divided into a CDDP group，CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group.Normal serum group was added to the corresponding pharmacological serum for 48 h.The expression levels of Bcl-2 and Bax in ovarian granulosa cells of rats in each group were detected by Western Blotting method，and the expression levels of Bcl-2 and Bax in ovarian granulosa cells of rats in each group were detected by RT-PCR.Results：Compared with the normal control group，the expression level of Bax gene and protein in CDDP group was up-regulated，with significant difference（P<0.05 or P<0.01）.Compared with CDDP group，the expression of Bax gene and protein in CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group decreased significantly（P<0.05）.Compared with the normal group，the expression of Bcl-2 in CDDP group decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）.Compared with CDDP group，the transcription level of bcl-2 gene in CDDP+estradiol group and CDDP+Erxian Decoction group increased significantly（P&lt;0.05）.Conclusion：Erxian Decoction can effectively inhibit the damage of ovarian granulosa cells induced by CDDP，and its mechanism may be related to the regulation of bcl-2/bax balance.

Key Words Erxian Decoction; Cisplatin; Serum containing Chinese medicine; Ovarian granulosa cells; Ovarian dysfunction; Infertility; B-cell lymphoma 2 protein family; Experimental study

中圖分類號：R289.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.009

順鉑（Cis-dichlorodiamine Platinum，cDDP）作為一線化療藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床，cDDP的作用機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡程序，殺死腫瘤細(xì)胞;在此過程中死亡受體通路以及多種蛋白質(zhì)參與其中，其中包括JNK信號通路、p53和Bcl-2家族蛋白等[1]。研究發(fā)現(xiàn)化療藥物在治療疾病的過程中不僅能夠殺死部分腫瘤細(xì)胞，同時也會對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[2]，而cDDP引起的女性生殖系統(tǒng)損害已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一[3]。有報(bào)道指出，cDDP能夠引起女性卵巢儲備功能下降（Diminished Ovarian Reserve，DOR），而DOR是形成卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF）的一個重要誘因[4]。李艷梅等[5]發(fā)現(xiàn)，cDDP會引起女性患者出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)、甚至POF。因此，在治療腫瘤的同時保護(hù)卵巢功能、減少卵巢損傷尤為重要。二仙湯對圍絕經(jīng)期綜合征的療效為臨床所公認(rèn)，其治療效果得到國內(nèi)外中醫(yī)界的認(rèn)同[6-12]。相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)采用石蠟切片及mallory染色的方法，觀察二仙湯對cDDP模型小鼠的保護(hù)機(jī)制，結(jié)果顯示，二仙湯能夠有效改善模型小鼠卵巢功能，抑制氧化應(yīng)激[7]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)二仙湯含藥血清能夠提高cDDP處理后顆粒細(xì)胞中E2、P表達(dá)，能夠降低卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率，同時二仙湯含藥血清能夠上調(diào)卵巢顆粒細(xì)胞中PI3k、p-Akt、Akt的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)PI3k/Akt信號通路途徑，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)建立cDDP處理卵巢顆粒細(xì)胞模型，通過觀察各組藥物干預(yù)后bcl-2/bax mRNA基因和蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步探究二仙湯含藥血清保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細(xì)胞 選取SPF級雌性SD大鼠（22～24 d）10只，體質(zhì)量（60±10）g，購自（北京）斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，使用許可證：SCXK（京）2011～0004。自由飲水，12 h/d光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，常規(guī)灌胃，制備藥理血清。本實(shí)驗(yàn)獲北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（No.BUCM-20160105081995）。10%水合氯醛麻醉處死后，立即置于75%乙醇中浸泡3 min，于超凈臺下取雙側(cè)卵巢，用預(yù)冷的Hank液清洗3次，將雙側(cè)卵巢置于無血清培養(yǎng)基中，刺破卵巢收集顆粒細(xì)胞。

1.1.2 藥物 二仙湯組方，淫羊藿9 g、巴戟天6 g、當(dāng)歸10 g、黃柏15 g、仙茅12 g、知母10 g。由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供，根據(jù)顆粒/飲片固有比計(jì)算，每只鼠用量：7.5 kg/d。注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37021358）、戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥有限公司，生產(chǎn)批號：B01007102）均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，戊酸雌二醇片每只大鼠用量：0.009 mg/kg。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，生產(chǎn)批號：SH-30023）;胎牛血清（美國Hyclone公司，生產(chǎn)批號：1300510）;孕馬血清促性腺激素（以色列Prospec公司，生產(chǎn)批號：hor-272）;BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20160627）、RIPA蛋白裂解液（北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：20160307）、SDS-PAGE分離膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：S1051）、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：S1052）蛋白相對分子質(zhì)量Marker（美國Thermo公司，生產(chǎn)批號：00332484）;ECL超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：P1010）;二抗Anti-RabbitIgG/HRP（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號：si30086）和Anti-MouseIgG/HRP（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號：si30086）;RNA提取試劑盒：Zymo Quick-RNATMMicroPrep（Catalog Nos.R1050&R1051）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒：M-MLV First Strand RT Kit（目錄號：RT03）;PCR酶：qPCR Master Mix（Catalog：DBI-2043）;bax、bcl-2抗體（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號：SC1309，SC1662）。

CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC，日本）;倒置顯微鏡（TS100，日本）;低溫離心機(jī)（3K15，美國）;多功能熒光酶標(biāo)儀（SAFIRE2，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 將卵巢顆粒細(xì)胞以5×105接種于96孔板中，待細(xì)胞生長至底壁的75% ～80%時，將細(xì)胞分為4組：正常組，cDDP組，cDDP+雌二醇組，cDDP+二仙湯組。除正常組外，其余各組每孔加200 μL（終濃度為2.5 μg/mL）cDDP進(jìn)行處理，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h。

參照文獻(xiàn)[21]血清制備方法，將SD大鼠隨機(jī)分為：正常組、雌二醇組、二仙湯組，每組灌胃3 d，于第4天7點(diǎn)末次灌胃1 h后，采用心臟取血方式，全血靜置2 h，離心提取血清，濾膜無菌過濾，-20 ℃保存。

1.2.2 給藥方法 cDDP誘導(dǎo)12 h后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)，正常組及cDDP組棄培養(yǎng)基，每孔均加入正常血清200 μL;cDDP+雌二醇組及cDDP+二仙湯組棄培養(yǎng)基，依次加入各組治療雌二醇、二仙湯含藥血清200 μL，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 蛋白印跡法（Western Blotting）檢測各組顆粒細(xì)胞中bax、bcl-2蛋白表達(dá)：分別提取各組卵巢顆粒細(xì)胞，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。經(jīng)SDS聚丙烯凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），一抗、二抗孵育后，使用發(fā)光底物進(jìn)行顯影，對bax、bcl-2蛋白進(jìn)行目的條帶定性和定量分析，處理圖像，分析目標(biāo)條帶。

RT-PCR檢測各組卵巢顆粒細(xì)胞中bax、bcl-2mRNA表達(dá)：提取各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，加入Trizol裂解后提取總RNA，加 dNTP、MMLV和Oligo（dT）15等進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，加入PCR引物擴(kuò)充目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，對bax、bcl-2的目的條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時，則采用Tamhance′sT2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞bcl-2、bax蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，cDDP處理后各組bcl-2表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常組比較，cDDP處理后各組bax蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bax蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖1、2。

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞bcl-2、bax mRNA表達(dá)的比較 與正常組比較，cDDP干預(yù)后各組bcl-2mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bcl-2mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與正常組比較，cDDP干預(yù)后，各組bax mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與cDDP組比較，cDDP+雌二醇組、cDDP+二仙湯組bax mRNA表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

DOR是指女性卵巢產(chǎn)生卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的能力下降，并可引起女性體內(nèi)性激素的異常、生育能力障礙，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀少，絕經(jīng)，不孕等[9]。導(dǎo)致DOR最常見醫(yī)源性因素即是化療藥物損傷?；熕幬镌跉⑺滥[瘤細(xì)胞的同時，存在著嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用，嚴(yán)重影響女性患者的身心健康。隨著癌癥、血液病及自身免疫性疾病發(fā)病率上升，化療藥物的使用率隨之上升，因此保護(hù)卵巢功能成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。

cDDP作為一線化療藥物，可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，刺激原始靜止卵泡過度活化，增加卵泡對藥物的敏感性，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡[10]。cDDP動物模型能夠增加顆粒細(xì)胞凋亡，加速卵泡募集，使卵泡閉鎖增多[11]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究已明確cDDP能夠建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型，而二仙湯中藥血清可以增加大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中E2、P的表達(dá)，延緩顆粒細(xì)胞損傷[8]。那么，二仙湯通過激活或抑制哪條信號途徑而發(fā)揮上調(diào)模型細(xì)胞中E2、P的作用呢？我們繼續(xù)探究，建立cDDP誘導(dǎo)原代卵巢顆粒細(xì)胞損傷模型，通過基因及蛋白角度，觀察顆粒細(xì)胞中PI3K、AKT的表達(dá)情況，結(jié)果顯示二仙湯改善損傷性卵巢顆粒細(xì)胞的作用機(jī)制，可能與激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)[9]。目前bcl-2、bax基因是最受關(guān)注的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，bcl-2能抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生存周期，而bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者相互拮抗，共同影響著細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。因此本實(shí)驗(yàn)通過cDDP處理大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，探究二仙湯是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路下游靶蛋白bax/bcl-2對cDDP大鼠卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)cDDP能夠誘導(dǎo)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞促進(jìn)凋亡基因bax表達(dá)、降低凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)，與張春燕和何援利[13]的研究結(jié)果一致。研究表明，卵泡的生長發(fā)育及閉鎖主要的作用靶點(diǎn)可能位于卵泡表面，依賴體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)及卵泡的三維結(jié)構(gòu)特性，通過調(diào)控顆粒細(xì)胞或卵母細(xì)胞生長增殖，而影響卵泡的作用[14]。在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中，PI3K/Akt信號途徑發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，活化的PI3K/Akt信號途徑，通過調(diào)節(jié)下游多個靶分子，參與細(xì)胞的凋亡[15]。AKT被磷酸化后可誘導(dǎo)bax/bcl-2、Caspase3/8/9和FOX家族磷酸化，影響細(xì)胞調(diào)亡[16];這與課題組近期工作發(fā)現(xiàn)相一致（論文待發(fā)表）。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白和基因水平均發(fā)現(xiàn)二仙湯能夠下調(diào)cDDP誘導(dǎo)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bax蛋白表達(dá)，上調(diào)bcl-2表達(dá)。bax/bcl-2之間的動態(tài)平衡是細(xì)胞代謝關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，bcl-2可以通過影響氧自由基、P53、活化Raf基因等途徑抑制細(xì)胞凋亡，而bax在接受死亡信號后，進(jìn)入線粒體膜，促使大量細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bax/bcl-2之間的動態(tài)平衡使細(xì)胞保持正常的代謝狀態(tài)，一旦這種增殖和凋亡的平衡被打破，細(xì)胞代謝將出現(xiàn)紊亂，引起疾病的發(fā)生[17-20]。同時，bcl-2能夠減少線粒體膜的通透性，抑制bax的促凋亡的生物學(xué)作用[18-21]。

綜上所述，二仙湯能夠通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，調(diào)控下游靶蛋白bax/bcl-2的平衡，改善CDDP誘導(dǎo)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞損傷，糾正顆粒細(xì)胞微環(huán)境，為臨床治療卵巢儲備功能低下等疾病提供理論依據(jù)。

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（2018-09-05收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）