趙巧雪 黃鎮(zhèn) 王瑋琪

摘 要：傳統(tǒng)構(gòu)建遺傳修飾小鼠的方法有2種，一種是采用顯微注射技術(shù)將特定核酸序列傳遞到小鼠受精卵或胚胎體內(nèi)，另一種是將小鼠的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入到囊胚中。較為廣泛應(yīng)用的是采用顯微注射技術(shù)將特定核酸序列傳遞到小鼠受精卵或胚胎體內(nèi)，即核酸傳遞方法，該方法可以通過注射方法、轉(zhuǎn)染方式及性腺組織介導(dǎo)進(jìn)行核酸傳遞。綜述構(gòu)建遺傳修飾小鼠過程中的核酸傳遞方法，包括原核注射、囊胚顯微注射、受精卵核酸電轉(zhuǎn)染、輸卵管核酸電轉(zhuǎn)染、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、卵巢組織注射等方法的研究進(jìn)展，并對核酸傳遞方法的進(jìn)一步利用和發(fā)展方向進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：遺傳修飾小鼠; 核酸物質(zhì)傳遞; 顯微注射; 電轉(zhuǎn)染; 基因編輯

Abstract： There are two traditional methods to build the genetically modified mouse model， one method is to use the microinjection to transfer specific nucleotide sequence into the fertilized eggs or embryos of mouse， while the other is to introduce the embryonic stem cells of mouse into the blastocyst. The first method， that is， nucleic acid transferring method， is widely used which can transfer the nucleic acid through injection method， transfection method and gonadal tissue mediate. The research progress of nucleic acid transferring method in the process of building genetically modified mouse model was summarized including pronucleus injection， blastocyst microinjection， the nucleic acid electrotransfection of fertilized eggs， the nucleic acid electrotransfection of oviduct， sperm-mediated gene transfer， ovarian tissue injection， etc. Then， the further usage and development direction of nucleic acid transferring method were prospected.

Key words： Genetically modified mouse;Nucleic acid transfer;Microinjection;Electrotransfection;Gene editing

傳統(tǒng)的構(gòu)建基因遺傳修飾小鼠方法是對體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因遺傳修飾，通過顯微操作注射到囊胚中，最終在得到的嵌合體小鼠中進(jìn)行篩選，得到基因遺傳修飾穩(wěn)定遺傳的小鼠[1-3]。但該技術(shù)需要長時(shí)間篩選胚胎干細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株，并且嵌合體小鼠的篩選周期較長。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對小鼠的基因組進(jìn)行基因編輯變得簡單和快速，同時(shí)，將核酸序列傳遞到小鼠受精卵或胚胎內(nèi)的方法也得到發(fā)展，構(gòu)建基因修飾動(dòng)物的方法更加多元化。基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）及CRISPR/Cas9系統(tǒng)（CRISPR/Cas9 system）等[4-6]，均可以在靶位點(diǎn)處切割DNA，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），并通過DNA損傷修復(fù)的兩條途徑——非同源末端連接（non-homologous ending-joining，NHEJ）或同源重組（homologous recombination，HR）實(shí)現(xiàn)對目的基因序列的敲除或插入[7]，從而對基因序列進(jìn)行定點(diǎn)編輯。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因設(shè)計(jì)簡單，操作成本低，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因修飾動(dòng)物[8]。該技術(shù)是將Cas9蛋白和sgRNA （mRNA或者質(zhì)粒元件）傳遞到小鼠受精卵中，進(jìn)行基因組的編輯，從而獲得遺傳修飾小鼠[9]。目前，關(guān)于如何將Cas9蛋白和sgRNA的核酸傳遞到受精卵中是影響高效構(gòu)建遺傳修飾小鼠的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前，原核顯微注射是應(yīng)用最廣泛的方法，該方法是將核酸通過特制的玻璃針注射到小鼠受精卵的細(xì)胞核中。由于其操作過程需要昂貴的顯微操作儀器，并且對操作人員的熟練程度要求極高[10]，因此，在對核酸高效傳遞到小鼠的受精卵或早期胚胎研究過程中，先后出現(xiàn)了多種將核酸傳入小鼠受精卵或胚胎中的新方法，包括注射、DNA轉(zhuǎn)染、性腺組織介導(dǎo)等方法，新的研究方法取得了不錯(cuò)的效果，但核酸傳遞效率有待進(jìn)一步提高。本文對構(gòu)建遺傳修飾小鼠過程中的核酸傳遞方法進(jìn)行綜述，分析各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為構(gòu)建其他模式動(dòng)物的遺傳修飾模型提供理論基礎(chǔ)。

1 通過注射方法進(jìn)行核酸傳遞

1.1 原核注射

原核注射（pronuclear injection）是將外源基因通過顯微操作技術(shù)注射到小鼠受精卵的原核中，使得含有目的基因的DNA片段隨機(jī)整合到小鼠基因組中，從而產(chǎn)生遺傳修飾小鼠[10]。原核注射技術(shù)自從面世以來，一直是研究熱點(diǎn)。近年來，隨著ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等新型基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，研究者們將基因編輯系統(tǒng)與原核注射技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建基因敲除或敲入的遺傳修飾小鼠。2010年Carbery等[11]結(jié)合了ZFNs與顯微注射技術(shù)，成功構(gòu)建了第1只基因敲除小鼠，2013年Sung等[12]首次將TALENs和顯微注射技術(shù)相結(jié)合成功構(gòu)建基因條件性敲除小鼠，Yang等[13]利用CRIPSR/Cas9技術(shù)和顯微注射技術(shù)成功構(gòu)建了第1只基因條件性敲除小鼠，2013年李勁松等[14]將sgRNA和Cas9蛋白注入患有白內(nèi)障小鼠的受精卵中后，發(fā)現(xiàn)有1/3新生小鼠的白內(nèi)障被治愈，并且能穩(wěn)定遺傳到下一代，表明白內(nèi)障遺傳疾病可以得到根治。2015年Liang等[15]首次將CRISPR-Cas9技術(shù)用于人類胚胎基因編輯。因此，原核注射目前仍然是構(gòu)建遺傳修飾小鼠主要的方法。雖然原核注射與基因編輯技術(shù)結(jié)合相比于傳統(tǒng)基于胚胎干細(xì)胞的構(gòu)建遺傳修飾小鼠方法簡單，但所需設(shè)備昂貴，對試驗(yàn)人員操作技術(shù)熟練程度要求極高。

1.2 囊胚顯微注射

囊胚顯微注射法是直接將核酸物質(zhì)注射到囊胚腔中，利用囊胚細(xì)胞隨機(jī)攝取外源DNA的特性，使得外源DNA隨機(jī)插入到囊胚細(xì)胞的基因組中，進(jìn)一步通過囊胚移植獲得轉(zhuǎn)基因的后代。1974年Jaenisch和Mintz等[16]第1次采用囊胚顯微注射法將猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）的DNA載體通過顯微注射技術(shù)注射到囊胚腔中，成功的轉(zhuǎn)染到滋養(yǎng)外胚層和一部分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，再將囊胚移植入代孕小鼠體內(nèi)，收獲子代嵌合體小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將近有40%的子代小鼠的基因組成功整合了外源DNA，但外源DNA是否能傳遞到下一代小鼠并沒有報(bào)道。該技術(shù)沒有被廣泛使用，主要原因是只有部分的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)能攝取外源DNA，進(jìn)行囊胚移植后即使能獲得轉(zhuǎn)基因后代，也需要經(jīng)過長期篩選過程;同時(shí)，該方法還需要應(yīng)用到顯微操作技術(shù)，且要求試驗(yàn)人員對囊胚顯微注射及囊胚移植入代孕母鼠子宮技術(shù)比較熟練。

2 通過轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行核酸傳遞

2.1 受精卵核酸電轉(zhuǎn)染

受精卵核酸電轉(zhuǎn)法（zygote electroporation of nucleases，ZEN）是利用電穿孔（electroporation）技術(shù)將外源基因傳遞到動(dòng)物受精卵，并將受精卵移植到代孕動(dòng)物體內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。2002年Grabarek等[17]首次證明了可以利用電穿孔技術(shù)將核酸物質(zhì)高效傳遞入小鼠受精卵中。但該方法的主要難點(diǎn)是受精卵的透明帶阻礙了核酸物質(zhì)的有效轉(zhuǎn)入，盡管去透明帶后提高了轉(zhuǎn)染效率，但透明帶對于受精卵著床及發(fā)育是至關(guān)重要的，去透明帶會(huì)導(dǎo)致受精卵成功發(fā)育成為個(gè)體的概率降低[18]。隨后，多位研究者提出了在電轉(zhuǎn)染前，利用酸性臺式液弱化透明帶的策略，在提高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)也保證小鼠胚胎發(fā)育過程的正常進(jìn)行[18-20]。2002年P(guān)eng等[21]將弱化透明帶策略應(yīng)用于利用電穿孔技術(shù)將Oct4-特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒傳遞到小鼠受精卵的過程中，成功下調(diào)小鼠胚胎中Oct4的表達(dá)。

2014年Kaneko等[22]首次成功利用電穿孔儀器（型號：NEPA21，NEPA GENE）對大鼠受精卵進(jìn)行基因編輯，將TALENs或CRISPR/Cas9基因編輯組件在特定脈沖條件下傳遞到受精卵中，最終有73%的子代大鼠基因組發(fā)生了遺傳修飾。相比于顯微注射只能對受精卵依次注射，采用電穿孔技術(shù)可以一次處理100個(gè)以上的受精卵，而且不需要對受精卵進(jìn)行弱化透明帶處理。之后，陸續(xù)有研究者利用不同于NEPA21的儀器通過電穿孔技術(shù)進(jìn)行基因編輯組件的傳遞，2015年Hashimoto等[23]將CRISPR/Cas9與電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合，成功在小鼠胚胎中實(shí)現(xiàn)基于電穿孔技術(shù)的外源基因敲入，2015年Qin等[24]利用電穿孔儀器ECM830將Cas9蛋白和sgRNA以及外源DNA模板一起通過電轉(zhuǎn)的方法傳遞到小鼠受精卵中，并結(jié)合體外移植技術(shù)將受精卵移植入代孕母鼠體內(nèi)成功收獲了外源基因敲入小鼠。之后，Wang等[25]成功利用ZEN技術(shù)構(gòu)建了敲入LoxP序列的條件性基因打靶小鼠。這種將基因編輯系統(tǒng)與電轉(zhuǎn)相結(jié)合的方法在核酸傳遞過程中對設(shè)備的要求簡單而且操作方便，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠過程中得到了廣泛應(yīng)用，未來更多實(shí)驗(yàn)室將會(huì)采用的核酸傳遞技術(shù)。

2.2 輸卵管核酸電轉(zhuǎn)染

輸卵管核酸電轉(zhuǎn)（genome-editing via oviductal nucleic acids delivery，GONAD）是將DNA注射到懷孕小鼠輸卵管中受精卵所在的壺腹部，再對壺腹部進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，將核酸傳遞到小鼠受精卵內(nèi)，從而收獲轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。1998年Relloso等[26]首次將攜帶β-半乳糖苷酶（Beta-galactosidase，β-Gal）報(bào)告基因的脂質(zhì)體注入到10只小鼠輸卵管腔中，2～5 d后將小鼠輸卵管進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中9只小鼠輸卵管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)β-Gal陽性。2005年Sato等[27]將質(zhì)粒DNA注入懷孕0.4 d的小鼠輸卵管的壺腹部，然后利用電轉(zhuǎn)儀對整個(gè)輸卵管進(jìn)行電轉(zhuǎn)，最終有43%概率成功將質(zhì)粒DNA傳遞到輸卵管的上皮細(xì)胞內(nèi);但是質(zhì)粒DNA不能成功電轉(zhuǎn)入位于輸卵管壺腹部的受精卵中，這可能是由于卵丘細(xì)胞阻礙DNA轉(zhuǎn)入受精卵。2012年Sato等進(jìn)一步嘗試對懷孕1.6 d的母鼠進(jìn)行試驗(yàn)，此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)與受精卵分離。研究結(jié)果表明，用EGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)1 d后，4～8個(gè)胚胎發(fā)出綠色熒光，但其后代中外源DNA并未整合在基因組上[28]。2015年Takahashi等將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與輸卵管核酸電轉(zhuǎn)結(jié)合，利用T820電轉(zhuǎn)儀將Cas9蛋白和sgRNA注射至懷孕1.6 d的母鼠輸卵管壺腹部，并施加特定的脈沖，發(fā)現(xiàn)25只子代轉(zhuǎn)基因小鼠中只有7只突變體[29]。該研究證明了體內(nèi)對著床前胚胎進(jìn)行基因編輯是可行的。

輸卵管核酸傳遞基因編輯技術(shù)是目前對著床前受精卵進(jìn)行基因編輯方法中最為簡單方便的方法，該技術(shù)不需要一系列復(fù)雜的步驟，也無需昂貴的顯微注射系統(tǒng)和熟練的受精卵顯微注射技術(shù)，未來能廣泛應(yīng)用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行遺傳修飾小鼠的制備。

3 通過性腺組織介導(dǎo)的核酸傳遞方法

3.1 精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移（Sperm-mediated gene transfer，SMGT）是在體外將外源DNA整合到精子后通過體外受精（in vitro fertilization，IVF）收獲轉(zhuǎn)基因子代的方法。1989年Lavitrano等[30]首次將小鼠的精子從尾睪中分離出來并與質(zhì)粒共孵育，結(jié)果表明，精子能與質(zhì)粒DNA結(jié)合。當(dāng)用結(jié)合質(zhì)粒DNA精子與卵子進(jìn)行IVF后，這些外源DNA有一定的概率被整合到受精卵的基因組上。利用精子介導(dǎo)的基因傳遞方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物簡單，并且不需要顯微注射設(shè)備。1998年Maione等[31]采用精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法在小鼠中進(jìn)行了大規(guī)模驗(yàn)證試驗(yàn)，共收獲130只轉(zhuǎn)基因后代，占收獲小鼠總數(shù)的7.4%。2002年Lavitrano等[32]在豬中進(jìn)行精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，獲得80%的轉(zhuǎn)基因豬，其中有64%具有遺傳穩(wěn)定性。在國內(nèi)，2006年沈偉等[33]采用DMSO精子介導(dǎo)技術(shù)將增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green flurorescent protein，EGFP）轉(zhuǎn)移至小鼠精子體內(nèi)，獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率高達(dá)41.7%。2007年，董煥聲等[34]利用精子介導(dǎo)技術(shù)將綠色熒光蛋白（green flurorescent protein，GFP）基因轉(zhuǎn)移到小鼠精子內(nèi)，體外受精后進(jìn)行體外培養(yǎng)，表達(dá)GFP胚胎的陽性率為4.7%，驗(yàn)證了精子介導(dǎo)制備轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的可行性。若CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)與精子介導(dǎo)技術(shù)手段結(jié)合一旦成功，相信精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用[35]。

3.2 卵巢組織注射

卵巢組織注射是通過病毒載體或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將外源DNA傳遞進(jìn)入卵巢細(xì)胞的技術(shù)。2001年Gordon等[36]嘗試將腺病毒注射到小鼠卵巢髓質(zhì)中感染卵巢細(xì)胞和卵母細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)即使加大病毒劑量也未發(fā)現(xiàn)被感染的卵母細(xì)胞。2004年Shimizu等[37]將包裝有外源質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)體注射到豬卵巢髓質(zhì)，該質(zhì)粒編碼豬生長分化因子9（growth differentiation factor-9，GDF-9），GDF-9是屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族的生長刺激因子，特異地在未成熟卵泡中表達(dá)。結(jié)果顯示，注射后的未成熟卵泡、次級和三級卵泡數(shù)量增加，研究人員認(rèn)為該結(jié)果是GDF-9在卵巢中過表達(dá)產(chǎn)生的，但并未闡述細(xì)節(jié)。2003年Sato等[38]嘗試通過在小鼠卵巢內(nèi)注射傳遞含有LacZ基因的質(zhì)粒到卵巢中，之后進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)。對電轉(zhuǎn)后的卵巢進(jìn)行X-gal染色，結(jié)果顯示8%～60%的卵泡帶有LacZ報(bào)告基因，部分包圍有1～2層卵泡的卵母細(xì)胞也呈現(xiàn)LacZ活性染色陽性。2007年Yang等[39]用相似的方法將DNA注射到小鼠卵巢中，進(jìn)而使DNA進(jìn)入卵母細(xì)胞中，在激素刺激下排卵后受精，發(fā)現(xiàn)子代轉(zhuǎn)基因小鼠中攜帶有外源DNA。這些研究證實(shí)了通過卵巢注射構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的可能性，但是如何同時(shí)將外源基因引入卵巢和卵母細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，在將外源核酸傳遞到小鼠的受精卵或胚胎中構(gòu)建遺傳修飾小鼠的不斷探索及研究過程中，通過性腺組織進(jìn)行核酸傳遞是最容易操作的方法，該方法雖然能得到一定概率的遺傳修飾小鼠，但是得到的遺傳修飾小鼠并不能穩(wěn)定地將遺傳修飾傳遞到子代。原核顯微注射技術(shù)是目前最為廣泛使用的用于構(gòu)建遺傳修飾小鼠的核酸傳遞方法，但該技術(shù)需要昂貴的顯微操作系統(tǒng)，且需要操作人員具有相當(dāng)熟練的原核顯微注射和體外移植受精卵技術(shù)，普通實(shí)驗(yàn)室難以在短時(shí)間內(nèi)方便熟練掌握。近年來，通過電轉(zhuǎn)染將外源核酸DNA和基因編輯系統(tǒng)的組件導(dǎo)入到小鼠受精卵內(nèi)的方法廣泛開展，尤其是在體內(nèi)對受精卵的輸卵管進(jìn)行電轉(zhuǎn)從而將核酸傳遞到受精卵內(nèi)的方法正在不斷進(jìn)步，該方法相對簡單，并且避免了昂貴的顯微操作系統(tǒng)的使用及對試驗(yàn)人員的技術(shù)要求高，具備廣闊的應(yīng)用前景?？傊?，在構(gòu)建遺傳修飾小鼠過程中，生物學(xué)家對如何提高核酸傳遞到受精卵的效率還在不斷地研究與探索，希望本文的論述可為開發(fā)新的方法提供理論研究基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）