羅曦

摘 要：基因編輯技術(shù)指能夠讓人類(lèi)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，相比鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN），有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中常遭遇各種物理、化學(xué)或生物性逆境，而阻礙其正常的生長(zhǎng)發(fā)育，這對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著極大的不利影響。本文通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外多篇相關(guān)文獻(xiàn)的研究，從基因編輯技術(shù)在多種植物中的作用，證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在植物育種中有著廣泛的運(yùn)用，對(duì)于提高植物抗逆能力，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：基因編輯 CRISPR/Cas9技術(shù) 定點(diǎn)突變 應(yīng)用

1.基因編輯

基因編輯 （gene editing） 是對(duì)生物體的基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定點(diǎn)修飾或者修改， 以改變目的基因或調(diào)控元件的序列、表達(dá)量或功能[1]。早期基因編輯技術(shù)包括歸巢內(nèi)切酶（HEs）、鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（TALEN），但是脫靶效應(yīng)或組裝復(fù)雜性限制了這些技術(shù)在基因編輯領(lǐng)域中的應(yīng)用。近年來(lái)，以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為代表的新型技術(shù)使基因編輯的研究和應(yīng)用領(lǐng)域得以迅速拓展。

CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為3個(gè)不同的類(lèi)型：I型、II型和III型，3個(gè)系統(tǒng)都包括目標(biāo)DNA、靶向cr RNA和PAM[2]。其中，來(lái)自嗜熱鏈球菌或化膿性鏈球菌的II型系統(tǒng)是用于基因組工程目的最多樣化的[3]。CRISPR/Cas9技術(shù)的基本原理就是將核糖體RNA （r RNA） 設(shè)計(jì)為引導(dǎo)RNA。使引導(dǎo)RNA包含位于5'-端的靶DNA的互補(bǔ)序列以及位于3'-端的cr RNA的類(lèi)似序列， 從而利用靶DNA的互補(bǔ)序列來(lái)定位需編輯的位點(diǎn)， 并通過(guò)cr RNA的類(lèi)似序列與Cas9結(jié)合， 僅設(shè)計(jì)引導(dǎo)gs RNA就可實(shí)現(xiàn)對(duì)含有前間區(qū)序列鄰近基序 （PAM） 序列的任一靶DNA序列進(jìn)行敲除、插入與定點(diǎn)突變等修飾[4]。

2.CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中的應(yīng)用

2.1模式植物中的應(yīng)用

擬南芥是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料，被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”。TCP基因家族是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。為了探究月季TCP9基因?qū)ㄆ鞴侔l(fā)育調(diào)控的影響，以擬南芥為受體，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并獲得轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化植株表型變異明顯，花瓣增多，雄蕊數(shù)目減少，雌蕊柱頭彎曲，最后通過(guò)測(cè)序分析表明了月季TCP9基因?qū)χ参锘ㄆ鞴侔l(fā)育調(diào)控有一定的影響[5]。

2.2農(nóng)作物中的應(yīng)用

水稻是稻屬中作為糧食的最主要最悠久的一種，區(qū)別于旱稻。水稻所結(jié)子實(shí)即稻谷，稻谷脫去穎殼后稱(chēng)糙米，糙米碾去米糠層即可得到大米。世界上近一半人口，包括幾乎整個(gè)東亞和東南亞的人口，都以稻米為食。為研究植物激素生長(zhǎng)素在模式作物水稻中的功能，何先暢等[6]利用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)兩個(gè)獨(dú)立靶位點(diǎn)gRNAs對(duì)水稻的生長(zhǎng)素合成基因YUCCA基因家族中的YUCCA1進(jìn)行了一次性定點(diǎn)編輯，得到3種突變類(lèi)型， 包括插入堿基A或T兩種類(lèi)型純合突變， 一種雜合突變類(lèi)型。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)3種突變株系都存在移碼現(xiàn)象而使氨基酸提前終止致使基因突變， 氨基酸的提前終止造成YUCCA1蛋白的失活。

棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一，在我國(guó)作為重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)原料，原產(chǎn)于美洲芝加哥，十九世紀(jì)末葉始傳入我國(guó)栽培。在棉花的生產(chǎn)中會(huì)面臨許多病蟲(chóng)害以及干旱、鹽脅迫的影響，導(dǎo)致減產(chǎn)或產(chǎn)品質(zhì)量低下等問(wèn)題。而基因編輯技術(shù)的應(yīng)用則為培育生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棉花提供了技術(shù)保障。無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)編輯的效應(yīng)。因此采用先酶切后PCR方式編輯效應(yīng)檢測(cè)是一種有效可靠的方法。U6啟動(dòng)子作為CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)的重要元件之一， 在李繼洋等[7]的研究中，證明了基于棉花內(nèi)源U6啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系在海島棉中的有效性， 表明該體系可以用于定向創(chuàng)制棉花的突變體， 為棉花功能基因組學(xué)研究提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

2.3水果中的應(yīng)用

柑橘類(lèi)水果所含有的人體保健物質(zhì)豐富，主要有：類(lèi)黃酮、單萜、香豆素、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)丙醇、吖啶酮、甘油糖脂質(zhì)等，有潤(rùn)肺、止咳、化痰等功效。研究表明柑橘潰瘍病病原菌的效應(yīng)因子PthA4進(jìn)入柑橘基因組后，特異識(shí)別并結(jié)合在CsLOB1基因啟動(dòng)子上，調(diào)控寄主內(nèi)CsLOB1的表達(dá)。在EBEPthA4附近創(chuàng)造更大片段的刪除有利于提高突變體植株抗所有柑橘潰瘍病株系的能力，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)CsLOB1啟動(dòng)子進(jìn)行多位點(diǎn)編輯，以獲得sgRNA區(qū)段之間發(fā)生刪除的抗柑橘潰瘍病的突變體植株。

葡萄為著名水果，生食或制葡萄干，并釀酒，釀酒后的酒腳可提酒食酸，根和藤藥用能止嘔、安胎。葡萄不僅味美可口，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。傳統(tǒng)葡萄育種是通過(guò)選擇適宜的父母本進(jìn)行雜交， 人工篩選優(yōu)良性狀的子代的方法既耗時(shí)又費(fèi)力。2017年中國(guó)科學(xué)院植物研究所利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)葡萄酒石酸合成的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了敲除， 成功降低了葡萄細(xì)胞中酒石酸的含量， 證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在葡萄中的可行性， 這對(duì)未來(lái)葡萄育種、基因改良具有重要的指導(dǎo)意義。

3.展望

隨著科技手段的不斷進(jìn)步，繼傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)的優(yōu)化改良，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。經(jīng)過(guò)眾多研究學(xué)者的不斷探索實(shí)踐，使得CRISPR/Cas9技術(shù)在植物的基因編輯領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用，相信隨著研究的逐漸深入，這項(xiàng)技術(shù)也將越來(lái)越安全成熟，將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到植物育種中，能更好地實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)，對(duì)人類(lèi)的生活質(zhì)量也能有更好地改善和提高。

參考文獻(xiàn)

[1] 邢國(guó)杰，李桐，鄭慧瑾，等.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及研究進(jìn)展與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，42（06）：28-30+35.

[2] 李翠，郝福順，孫立榮.利用CRISPR/Cas9技術(shù)可有效沉默擬南芥NADK2基因[J].農(nóng)家參謀，2018（16）：219-221+267.

[3] 謝磊，王姍珊，胡博文，等.基于CRISPR/Cas9技術(shù)的月季TCP9基因轉(zhuǎn)化擬南芥[J].分子植物育種，2017，15（03）：928-933.

[4] 何先暢，黃國(guó)強(qiáng)，王道洋，等.利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得水稻OsYUCCA1基因突變體[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（11）：4778-4784.

[5] 楊海河，畢冬玲，張玉，等.基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻pi21基因編輯材料的創(chuàng)制及稻瘟病抗性鑒定[J].分子植物育種，2017，15（11）：4451-4465.

[6] 何暢，姜玲，劉春林，等.甘藍(lán)型油菜BnaSDG8基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建及功能探究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，44（04）：346-352.

[7] 李繼洋，雷建峰，代培紅，等.基于棉花U6啟動(dòng)子的海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯體系的建立[J].作物學(xué)報(bào)，2018，44（02）：227-235.